Способ диагностики атеросклероза

 

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологическим методам диагностики, и может найти применение при диагностике сердечно-сосудистых заболеваний, в частности прогрессивного течения атеросклероза. Цель изобретения - повышение точности способа. Производят забор крови от больного, разделяют ее на две порции. Из одной порции получают аутологичные липопротеиды путем осаждения белков сыворотки в присутствии хлористого кальция, а из другой порции выделяют лейкоциты. Затем ставят реакцию ингибиции миграции лейкоцитов в присутствии липопротеидов и при увеличении процесса мигрирующих клеток не более, чем на 30% по сравнению с пробой без липопротеидов диагностируют прогрессирующую форму атеросклероза. По сравнению с прототипом отмечается повышение точности диагностики на 30%.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) (11) 1529121 А 1

lg1) g (: 01 N 33/53 р.

+c jr,уу

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А BTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТ8ЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЬПИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4334977/28-14 (22) 08.12.87 (46) 15.12.89. Бюл, )1 46 (j1) Научно †исследовательск институт экспериментальной медицины

АН СССР и 1-й Ленинградский медицинский институт им. акад, И.П. Павлова (72) А.Н. Климов, В. А. Нагорнев, П.В. Пигаревский, P.Ï. Огурцов, А.Д. Денисенко и Е. Г. Сергеева (53) 615.375 (088.8) (56) Нагорнев В.А. и др. Атеросклероз и система иммунитета, 1985, Р 4, с. 15-21. (54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ATEPOCKJlEPO3А (57) Изобретение относится к медици— не, а именно к иммунологическим методам диагностики, и может найти приI

Изобретение относится к медицине, а именно 1» иммунологическим способам диагностики, и может найти применение при диагностике сердечно-сосудистых заболеваний, в частности прогрессив— ных форм атеросклероза.

Цель изобретения — повышение точности способа.

Способ осуществляется следующим образом.

10 мл венозной крови пациента делят на две части. Из первой получают лейкоциты обычным способом, иэ второй — липопротеиды преципитационным способом — осаждением гепарином в в присутствии солей кальция, Дпя этого к 1 мл плазмы крови прибавля2 менение при диагностике сердечно-сосудистых заболеваний, в частности прогрессивного течения атеросклероза. Цель изобретения — повышение точности способа. Производят забор крови от больного, разделяют ее на две порции. Из одной порции получают аутологичные липопротеиды путем осаждения белков сыворотки в присутствии хлористого кальция, а из другой порции выделяя;т лейкоциты, затем ставят реакцию ингибиции миграции лейкоцитGв в присутствии липопротеидов и при увели ении процесса мигрирующих клеток не более чем на 30% по сравнению с пробой без липопротеидов диагностируют прогрессирующую форму атеросклероза. По сравнению с прототипом отмечается повышение точности диагностики на 30%. ют 10 мп дистиллированной воды, О,?5 мл 2М раствора кальция хлористого (СаС1 ) и 0,08 мл гепарина (5000 ед./мл). Затем зту смесь центрифугируют при 3000 об,/мин при 4 С в течение 1 ч. Образовавшийся осадок растворяют в 2 мл 5%-ного раствора натрия хлористого и разбавляют в 20-50 раз физиологическим раствором хлористого натрия для получения раствора липопротеидов с концентрацией 10-150 мкг/мл, Затем в 2 лунки, проделанные в слое (3-4 мм) агарозы, вносят 0,1 мл взвеси лейкоцитов в физиологическом растворе. После этого в одну лунку добавляют 0,1 мл физиологического раствора (контроль), 1529121 а в другую — 0,1 мл раствора липопротеидов в концентрации 10-!50 мкг/мл.

Полученную систему инкубируют при

37 С во влажной атмосфере с 2 . СО в течение 8 ч.

Величину пробега лейкоцитов {зону миграции) в обеих лунках определяют под микроскопом. При уменьшении миграции лейкоцитов во второй лунке по сравнению с контролем на 30 и более судят о наличии аутосенсибилиэации и тем самым о прогрессирующем характере атеросклеротического про цесса. 15

Пример 1. Больной И.,51 год.

Поступил в клинику 25.03.86. Клини— ческий диагноз: ишемическая болезнь сердца (ИБС). Атеросклероз коронарных артерий. Нестабильная стенокардия, прогрессирующая стенокардия напряжения, Ш-й функциональный класс, повторные приступы острой коронарной недостаточности. Атеросклеротический и постинфарктный кардиосклероз (ост- 25 рый инфаркт миокарда в 1983 г.).

14 апреля 1986 r. у больного иэ вены берут 10 мл крови для реакции ингибиции миграции лейкоцитов (РИМЛ).

Из 5 мл получают лейкоциты, иэ других 5 мл — липопротеиды, К 1 мл плазмы крови прибавляют

10 мл дистиллированной воды, 0,25 мл

2 М раствора СаС! и 0,08 мл гепарина (5000 ед./мл). Смесь тщательно перемешивают и помещают в холодильник

35 при 4 С на 1 ч. После этого смесь

О центрифугируют при 3000 об./мин в течение часа. Надосадочную жидкость отбрасывают, а осадок растворяют в

2 мл 5 -ного раствора хлористого натрия..Получившийся раствор разбавляют в 50 раэ физиологическим раствороМо TeM cBMblM концентрацию липопротеидов доводят до 10 мкг/мл, Кон- 45 центрацию белка определяют по Лоури.

К 100 мг порошка агароэы (Sigma) приливают 8 мл би-дистиллированной воды, и смесь помещают в водяную баню до полного растворения агарозы.

В растворенную теплую агароэу вливают 1,5 мл физиологического раствора; 4,25 мл дистиллированной воды;

1,5 мп человеческой сыворотки;

0,3 мл бикарбоната натрия и 0,02 мл раствора пенициллина, содержащего

25000 ед. в 1 мл.

Всю смесь тут же разливают по микрочашкам Петри, по 3 мл в каждую чашку. После застывания (примерно через 20 мин) в агарозе пробивают стандартным пробойником лунки (3 мм в диаметре) °

Взвесь лейкоцитов получают путем лиэиса эритроцитов хлористым аммонием. К взвеси лейкоцитов приливают

0,85 .-ный раствор хлористого аммония, и смесь трижды центрифугируют при 3000 об./мин по 7 мин. Полученный осадок клеток ресуспендируют путем добавления 0,4 мл физиологического раствора.

В 2 лунки чашки Петри вносят по

О,l мл взвеси лейкоцитов,. затем в первую добавляют 0,1 мл физиологического раствора (контроль) во вторую—

0,1 мл аутолипопротеидов. Чашки ино кубируют при 37 С во влажной атмосфере с 2 СО в течение 8 ч.

Под микроскопом (увеличение в

200) с помощью окуляр-микрометра в обеих лунках измеряют величины пробега лейкоцитов, В первой — 15 усл. ед., а во второй — 9,3 усл.ед., т.е. наблюдаемое сокращение пробега во второй лунке составило 62 ..

18 апреля 1986 г. больной скончался от острой сердечно-сосудистой недостаточности, которой предшествовал затяжной приступ спонтанной стенокардии.

При патологоанатомическом исследовании коронарных артерий и аорты отмечено прогрессирующее развитие атеросклеротических поражений, поскольку наряду с фиброзными бляшками видно образование свежих липидных пятен, сливающихся между собой, В атеросклеротических бляшках наблюдается слоистое распределение соединительной ткани и пенистых клеток, что указывает на волнообразное течение процесса, характерное для быстротекущего процесса с иммунологическим компонентом. Однако, проведенное ранее исследование РК!Л с донорскими липопротеидами не выявило торможения миграции лейкоцитов по сравнению с контролем, и тем самым показало отсутстГ вие сенсибилизации.

Пример 2. Больной А., 60 лет.

Клинический диагноз: ИБС. Атеросклероз коронарных артерий. Стенокардия напряжения II-ro функционального класса. Атеросклеротический кардиосклероз. Гипертоническая болезнь IIII-й стадии. Более 10 лет страдает 15291 фармула изобретения

Составитель В. Литовченко

Редактор Т. Парфенова Техред,g.äèäûê.Корректор С. Черни.Заказ 7634/39 Тираж 789 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r.Óæãoðoä, ул. Гагарина, 101 гипертонической болезнью медленно прогрессирующего течения с хорошим эффектом гипотензивной терапии.

В 1979 г. появилась стенокардия напряжения — сжимающие боли за грудиной

5 возникают на фоне длительной физической нагрузки, при подъеме по лестнице на III-й этаж. Стенокардия носит не тяжелый, стабильный характер.

При постановке РИМЛ с использованием аутолипопротеидов, разбавленных в 30 раз (40 мкг/мл), не наблюдалось торможения миграции лейкоцитов по сравнению с контролем, также как и при постановке РИМЛ с донорскими липопротеидами, как в прототипе. Течение заболевания стабильное, без признаков обострения и прогрессирования, С помощью предлагаемого способа изучено 305 больных ИБС, из них у

93 обнаружена прогрессирующая форма жгеросклеротического процесса (по прототипу — 29 больных), некоторым больным назначена иммунокорректирующая терапия.

Предлагаемый способ, основанный на реакции с собственными липопро21 6 теидами, исключительно точен и дае одноЗначный ответ, что позволяет своевременно назначить больным соответствующую иммунокорректирующую терапию. Способ-прототип приблизительно в ЗОХ случаев не позволяет выявить прОгрессирующее течение заболевания, что связано с серьезными осложнениями для больного. Способ очень быстр в исполнении, его продолжительность:— около 12 ч, в то время как способапрототипа — более 1 сут.

Способ диагностики атеросклероза путем добавления к лейкоцитам больных липопротеидов с последующей оценкой реакции ингибиции миграции лейкоцитов и при наличии ингибирования реакции диагностируют атеросклероз, отличающийся тем, что, с целью повышения точности диагностики прогрессирующего течения атеросклероза, к лейкоцитам добавляют липопротеиды, полученные из крови того же больного,