Способ диагностики инсулинзависимого сахарного диабета

 

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для иммунодиагностики инсулинзависимого сахарного диабета. Цель изобретения - повышение точности способа и его упрощение. У пациентов берут кровь, выделяют сыворотку, инактивируют ее прогреванием, наносят на среды поджелудочной железы взрослой крысы, срезы инкубируют в течение 60 - 120 мин во влажной камере при комнатной температуре. Затем среды отливают и повторно инкубируют с меченной имунной сывороткой против иммуноглобулина G, учет результатов осуществляют по специфическому цитоплазматическому свечению островковых клеток. По сравнению с прототипом повышается точность диагностики путем снижения уровня гипердиагностики на 18,2% и достигается упрощение способа путем использования для тест-системы срезов поджелудочной железы крыс, что исключает приготовление для этих целей срезов поджелудочной железы внезапно умерших людей.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (!9) (И) А1 (50 4 G 01 N 33/53

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ (I

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

К А BTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4353773/28-14 (22) 31.12.87 (46) 07.12.89. Бюл. У 45 (71) Институт иммунологии (72) Е.Н.Злобина, Ю.N.Демин и В.И.Есенин (53) 615.375 (088.8) (56) Sricanta S., Rabizaden А. and

et. Diabetes. — 1985, v. 34, р. 300305. (54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ИНСУЛИНЗАВИСИГ10ГО САХАРНОГО ДИАБЕТА (57) Изобретение относится к медицине и может быть использовано для иммунодиагностики инсулинзависимого сахарного диабета. Цель изобретения повышение точности способа и его упрощение. У пациентов берут кровь, выделяют сыво ро тку, инактив ируют е е

Изобретение относится к медицине, может быть использовано для иммунодиагностики инсулинзависимого сахарного диабета (I типа) .

Целью изобретения является повышение точности способа и его упрощение.

Способ осуществляют следующим образом °

Получают поджелудочную железу от крыс линии Вистар весом 200-250 г, готовят криосрезы толщиной 8 микрон и проводят постановку непрямой реакции иммунофлуоресценции, включающей инкубацию с инактивированной при о

+56 С 30 мин, разведенной в 2-3 раза сывороткой больных, в течение 60 мин при комнатной температуре, отмывку прогреванием, наносят на срезы поджелудочной железы взрослой крысы, срезы инкубируют в течение 60120 мин во влажной камере при комнатной температуре. Затем срезы отливают и повторно инкубируют с меченой иммунной сывороткой против иммуноглобулина С, учет результатов осуществ ляют по специфическому цитоплазматическому свечению островковых клеток.

По сравнению с прототипом повышается точность диагностики путем снижения уровня гипердиагностики на 18,27 и достигается упрощение способа путем использования для тест-системы срезов поджелудочной железы крыс, что исключает приготовление для этих целей срезов поджелудочной железы внезапно умерших людей.

0,02 Г1 фосфатным буфером рН 7,4, содержащим 0,15 M хлористого натрия (ФБС), и 0,017-ным аэидом натрия

3 раза, инкубацию с ФИТЦ-меченой антисывороткой к иммуноглолубину G человека в течение 60-120 мин при ком-, натной температуре, отмывку ФБС с

О, 01 %-ным азидом натрия 3 раза, заключение препаратов в глицерол, учет относительной интенсивности реакции иммунофлуоресценции на фотомикроскопе по шкале О, I, IT, III, IV, дифференцированный учет окрашивания островков срезов поджелудочной железы (специфическая реакция) .

Пример 1. Больной Н.ЗО лет.

В сентябре 1987 года появилпсь жало1527594

1О бы на сухость во рту, жажду, похудание на 11 кг, обипьной мочевьделение, Госпитализирован 1.Х.87 года в клиническую больницу Р 6 (филиал) с подозрением на сахарный диабет. 7.Х.87 года проведено комплексное иммунологическое обследование: аутоантитела к цитоплаэматическим детерминантам островковых клеток (+), поверхностным (+), цитотбксическое действие аутоантител. У больного диагностирован сахарный диабет (СД) I типа, в связи с чем начата инсулинотерапия. Больной выписан 29.Х.87 года с улучшением.

Постановку теста на наличие ауто антител к цитоплазматическим дитерминантам островковых клеток проводят следующим образом, Приготовляют криосрезы поджелудочной железы крысы, при этом используют орган взрослой крысы (масса тела 250 r),. Железу извлекают немедленно после забоя животного °

Тканевые блоки размером 8"8 мм помещают на картонные кружки с соответствующей маркировкой, после чего замораживают погружением в жидкий азот, Последующее хранение осуществляют в ниэкотемпературном холодильнике при о

-70 С в плотно закрытых чашках Петри, Для получения криосрезов блок железы прикрепляют к объектодержателю и переносят в криостат "МК-25". Температуру в камере криостата поддерживают до -18 С. Срезы толщиной 8 мкм монтируют на стандартные предметные стекла, предварительно покрытые

О, 01 X-ным раствором поли-L -лизина, чтобы обеспечить прочную фиксацию срезов. Высушивают срезы при комнатной температуре 30 мин, фиксируют в ацетоне при комнатной температуре в . ° течение 5 с (в стандартном штативе для окрашивания мазков крови), переносят ФБС с 0,01Х-ным азидом натрия °

Сыворотку больного инактивируют в водяной бане при +56 С в течение

30 мин, затем ее разводят ФБС в

2 раза.

Стекла со срезами Р 1, 2, 3, 4i, помещают во влажную камеру. На срез

-N 1 наносят микропипеткой 40 мкл сыворотки больного, инактивированной и разведенной ФБС в 2 раза. На срез

М 2 наносят 40 мкл сыворотки здорового донора, также ииактивированной и разведенной ФБС в 2 раза. На срез

Р 3 наносят 40 мкл ФБС. На срез Р 4 наносят 40 мкл ранее тестированной

55 сыворотки больного сахарным диабетом

I типа с имеющимися аутоантителами к цитоплаэматическим дете рминантам остI ровковых клеток. Время инкубации для всех срезов составляет 60 мин во влажной камере при комнатной температуре, Затем срезы помещают в кювету с раствором ФБС с 0,017-ным аэидом натрия и инкубируют в течение 5 мин при комнатной температуре.

После э то го рас тво р сливают и лов вторяют процедуру трижды.

IIo завершении этой процедуры срезы вынимают из кюветы с раствором

ФБС, удаляют избыток влаги промоканием фильтровальной бумагой.

На срезы h" 1-4, помещенные во влажную камеру, наносят по 40 мкл

ФИТЦ-меченой антисыворотки к иммуноглобулину С человека и инкубируют ,60 мин при комнатной температуре.

Повторяют этап отмывки раствором азида натрия трижды и удаляют избыток влаги. Докрашивают срезы Р 1-4 0,05Хным раствором толуидинового синего, приготовленного на ацетатном буфере (рН 5,2) .для быстрой идентификации островков в проходящем свете. После окраски срезы погружают.последовательно в несколько кювет с дистиллированной водой до полной отмывки, тем

1 самым удаляют избыток красителя-толуидинового синего. Удаляют избыток влаги с поверхности препаратов с по-" мощью фипьтровальной бумаги. На покровное стекло наносят разогретый до о

40 С раствор глицеролжелатины и таким же покровным стеклом накрывают срезы.

Затем осуществляют просмотр срезов в проходящем свете и идентификацию островков Лангерганса, а также ведут учет флуоресцирующЪх объектов с использованием фотомикроскопа. На срезе Р 1 отмечено Цитоплаэматическое свечение островковых клеток, степень свечения 1-11. В этом препарате отсутствует окрашивание ацинарной ткани. На срезах Р 2 и 3 отсутствует реакция с островковыми клетками и . ацинарной тканью. На срезе Р 4 отмечено цитоплаэматическое свечение островковых клеток, ацинарная ткань не ок рашен а .

Были проверены сыворотки больных в сформированных по клиническим анализам группах СД I типа — смешанная возрастная группа из 23 человек и СД

Формула изобретения

Составитель В.Литовченко

Редактор И.Горная Техред М.Дидык Корректор А. Об руч ар

Заказ 7507 J51 Тираж 789 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101

5 15275

II типа — 22 человека на срезах поджелудочной железы человека и крысы.

Группу здоровых доноров использовали

s качестве отрицательного контроля.

Быпо выявлено, что высокая частота выявления специфического свечения при работе со срезами поджелудочной железы человека не отражает истинного проц(%та выявления этого признака. 10

Основанием для такого суждения служит значительный процент выявления неспецифических реакций сыворотки больных

СД II типа на срезах поджелудочной железы (п/ж) человека (18,2Х), а так- 15 же случай обнаружения аутоантител в сыворотке здорового человека при использовании среза человека, При работе на срезах п/ж крысы полностью отсутствовали неспецифические реакции 20 сыворотки пациентов СД II типа ипи здоровых доноров с островковыми клетками, т.е. практически отсутствует гипердиагностика заболевания при использовании предлагаемого способа.

Таким образом предлагаемый способ обеспечивает получение более достоверных результатов в иммунодиагностике СД I типа, полезен для прогно- 30 зирования возможного заболевания СД

I типа и в дифференциальной диагностике СД, По сравнению с имеющимися методами позволяет избежать гипердиагностики. Метол более прост в исполнении, так как используют и/ж лабораторных животных, а не п/ж внезапно умерших людей, т.е. облегчается доступность получения ингредиента для тест-системы. Метод может быть рекомендован в клинике для диагностики

СД.

Способ диагностики инсулинзависимого сахарного диабета, включающий забор крови у больного, выделение сыворотки, нанесение ее на препарат криосреза поджелудочной железы, инкубацию, отмывку срезов с последующей их инкубацией с меченой антисывороткой к человеческому иммуноглобулину и при наличии специфического свечения в препарате диагностируют инсулинэависимый сахарный диабет, о т л ич а ю шийся, тем, что, с целью повышения точности способа и его упрощения, сыворотку крови больного перед нанесением на препарат криосреэа прогревают и после отмывки препарата инкубируют с меченой антисывороткой в течение 60-120 мин, причем используют криосреэы поджелудочной железы взрослой крысы.