Способ определения изотипов антител

 

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, может быть использовано при определении антител любого изотипа, независимо от соотношения их активности с активностью антител других изотипов. Целью изобретения является повышение точности определения. Разработан способ определения изотипа антител, заключающийся в параллельной обработке исследуемой пробы смесями сывороток, каждая из которых содержит в заранее подобранных дозах антитела к тяжелым цепям иммуноглобулинов всех, кроме одного изотипов. Смеси выдерживают в течение 1,5-2 ч при 37°С, вносят в них полиэтиленгликоль 6000 до конечной концентрации 1,5%. Полученные смеси после экспозиции в течение 0,5-1,0 ч при 18-22°С центрифугируют на холоду в течение 20-30 мин при 20 тыс. об/мин и полученные варианты надосадков исследуют серологически в сравнении с необработанной сывороткой (контроль). Способ обеспечивает точную характеристику активности антител каждого из известных основных изотипов.

союз советских социдлистичесних

РЕСПУБЛИК (19) (и) 981 А1 (б)) 4 G 01 N 33/53

14 1Яв

1;,,5fiitw I 3,-"

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н A BTOPCHOIVIY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ пО изОБРюениям и ОтнРытийм

ПРИ ГКНТ СССР

"(21) 4278869/28-1.4 (22) 06.04.87 (46) 23.10.89. Бюл. У 39 (71) Научно-исследовательский институт эпидемиологии, микробиологии и .инфекционных болезней (72) Б.В.Каральник, Ю.В.Теплухин и П.Н.Дерябин (53) 616.373 (088,8) (56) Авторское свидетельство СССР

1"- 1074531, кл. G 01 N 33/53, 1984.. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИБО 1 ПОВ АНТИТЕЛ (57) Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано при определении антител любого изотипа, независимо от соотношения их активности с активностью антител других изотипов. Целью изобретения является повышение точИзобретение относится к медицине, а именно к иммунологии.

Целью изобретения является повышение точности определения антител различных изотипов, независимо от соотношения их активности с активностью антител других изотипов.

Поставленная цель достигается путем параллельной обработки исследуемой пробы до исследования смесями сывороток, каждая иэ которых содержит антитела к тяжелым цепям иммуноглобулинов всех, кроме одного, изо типов (одна сыворотка содержит антитела ко всем тя:.:елым цепям, кроме еС, другая со всем, кроме 1п, третья ко

2 ности определения. Разработан способ определения изотипа антител, заключающийся в параллельной обработке исследуемой пробы смесями сывороток, каждая из которых содержит в заранее подобранных до з ах антитела к тяжелым цепям иммуноглобулинов всЕх, кроме одного иэотипов. Смеси выдерживают в течение 1,5-2 ч при 37 С, вносят в них полиэтиленгликоль 6000 до конечной

«онцентрации 1,57.. Полученные смеси после экспозиции в течение 0,5-1,0 ч при 18-22 С центрифугируют на холоду о в течение 20-30 мин при 20 тыс. об/мин и полученные варианты надосадков исследуют серологически в сравнении с необработанной сывороткой (контроль).

Способ обеспечивает точную характеристику активности антител каждого из известных основных изотипов.

3 табл . всем, кроме ), и т.д.), последующей экспозиции смесей в течение 1,5-2 ч, удаления образовавшихся иммунных комплексов и последующего определения активности антител.

Пример 1. Выбор разведений ан тиглобулиновых сыво рота к . Иссле— дуемую сыворотку больного описторхозом в разведении 1:3 разделяют на

10 частей по 0,2 мл. Первую — третью части смешивают с 0,2 мл анти- с сыворотки (в разведении 1:50, 1:100 и

1:200 соответственна), четвертую шестую части — с анти в 1О сывороткой в таких же разведениях, седьмую — девятую части — с анти- $ сывороткой в

l 5 l 6981

35 тех же разведениях, десятую часть с таким же объемом 0,857-ного раствора хлорида натрия (контроль). Все части выдерживают в течение 2 ч при

37 С. Затем удаляют образовавшиеся иммунные комплексы. Для этого в каждую часть вносят по 0,4 мл 37.-ного раствора полиэтиленгликоля 6000. Через 30 мин смеси центрифугируют при

200 тыс. об/мин в течение 20 мин °

Надосадочные жидкости исследуют (каждую в четырех повторностях) при помощи РПГА с описторхозным диагностикумом. 15

Результаты приведены в табл. l.

Из табл. 1 видно, что наибольшее снижение активности антител в исследуемой сыворотке происходит в результате обработки каждой антиглобулинной 20 сывороткой в разведении 1/100. Следовательно, каждая из смесей антиглобулиновых сывороток должна содержать соответствующие сыворотки в разведении 1/100. 25

H p и м е р 2. Выбор условий экспозиции исследуемой сыворотки и смеси антиглобулиновых сывороток. Обработку сыворотки больного описторхозом смесью анти- — анти- Ь сывороток проводили аналогично примеру 1. Отличия заключались только в различных условиях экспозиции исследуемой сыво— ротки со смесью указанных антиглобулиновых сывороток.

Результаты приведены в табл. 2.

Титр общей активности антител до обработки смесью антиглобулиновых сывороток составлял 1:800. Наибольшее снижение титра РПГА произошло при 40

37 С и экспозиции не менее 90 мин.

Значительное увеличение экспозиции технически нецелесообразно . Следовательно, оптимальными условиями экспоо зиции являются температура 37 С и 45 длительность обработки сыворотки

l,5-2 ч.

П р и M e p 3. Исследованы при помощи РПГА сыворотки крови двух больных аписторхозом (А-а и Д-й) и

50 одного больного дизентерией (П-а) .

По известному способу каждую исследуемую пробу сыворотки титровали, начиная с разведения 1".6, в объеме

О 025 мл в четырех рядах. Во все лунЭ

55 ки первого ряда (контроль) внесли в объеме 0,025 мл растворитель — забуференный, рН 7,2, 0,853-ный раствор хлорида натрия. Во все лунки второго ряда в том же объеме внесли анти- сыворотку в заранее подобранном разведении 1:100, третьего ряда — анти-Ю сыворотку в заранее подобранном разведении 1:100, четвертого ряда - анти- р сыворотку в заранее подобранном разведении 1:100. После выдерживания смесей при 37 С в течение 30 мин во все разведения сыворотки больных описторхозом внесли по 0,025 мл 0,53ного описторхоэного, а рядов сыворотки больного дизентерией — дизентерийного антигенного эритроцитарного диагностикума. Результаты учли через

2 ч (табл. 3) . Исследование каждой сыворотки провели дважды.

По предлагаемому способу исследуемую пробу сыворотки в разведении 1:3 разделили на четыре части по 0,2 мп.

В первую часть (контроль) внесли

0,2 мл растворителя (забуференный, рН 7,2, 0,085Х-ный раствор хлорида натрия), во вторую — 0,2 мл смеси, содержащей анти- сГ.(1:100) и анти-Р (1:100) сыворотки. В третью внесли

0,2 мп смеси, содержащей анти- (1:100) и анти- р (1:100) сыворотки, в четвертую — 0,2 мл смеси, содержащей анти- f (1:100) и анти- o4(1:100)

d сыворотки. Смеси выдерживали при 37 С в течение 2 ч. Затем в каждую смесь внесли по 0,4 мл 37.-ного раствора полиэтиленгликоля 6000. Через 0,5 ч после этого все четыре смеси центрифугировали при 20 тыс. об/мин в течение 20 мин. Надосадочную жидкость каждой пробы титровали в одном ряду с разведением 1:12 в объеме 0 05 мл.

Во все разведения каждой сыворотки внесли по 0,025 мл 0,57-ного соответствующего антигенного эритроцитарного диагностикума. Результаты учли через 2 ч (табл. 3). Исследование каждой сыворотки провели дважды.

По известному способу обработка анти- сывороткой, возможно, снижает титр РПГА, но последний точно учесть не удается, так как слабая агглютинация (на 1+ или 2+) продолжается дальше — до 1:96 — 1:144 по сравнению с четко (на 3+ или 4+) выраженной агглютинацией — до 1:48 .

Даже если весьма условно учитывать реакцию только на Э+ и 4+, оценить изотиповую принадлежность антител в исследуемой сыворотке можно было бы только приблизительно — сравнением результатов в колонках 3-5 с конт151698 рольным результатом (колонка 2 табл. 3) ° Ha этом основании можно было бы только судить о том, превышает ли активность антител, относящихся, например, к иэотипу IgG активность антител других изотипов. По такой ориентировочной оценке можно полагать только, что активность IgG антител в сыворотках, вероятно, вьппе активности антител других изотипов.

По известному способу антитела изотипов IgA u IgM у больных описторхозом не выявлены, а у больной дизентерией выявлены только IgM антитела.

По предлагаемому способу в исслецованных сыворотках больных описторхозом активность антител к описторхозному антигену содержится, в основном, в изотипе IgG: инактивация антител других изотипов — IgA u IgM (ко— лонка 7 табл. 3) не снижает или почти не снижает титр РПГА по сравнению с контролем. Существенно меньшая активность антител содержится в иэотипе

IgM (колонка 9) и особенно в иэотипе

IgA (колонка 8), но антитела этих изотипов четко выявляются. В сыворотке больной дизентерией по предлагаемому способу определена наибольшая активность антител изотипа IgM, меньшая — IgG и минимальная - IgA.

Исследованная сыворотка больной дизентерией была разделена на фракции на колонке с сефадексом G 200. Полу чены три пика — IgM, IgA u IgG. Исследование активности антител в каж-! дом из этих пиков показало, что в сыворотке наиболее высока активность ,IgM антител, но активность антител, хотя и менее выраженная, обнаружена в пиках IgG u IgA. Таким образом, результаты, полученные предлагаемым способом, находятся в более точном соответствии с результатами иммунохимического фракционирования сыворотки, чем результаты, полученные известным способом. По предлагаемому способу можно выявить активность антител двух и более изотипов в тех пробах, где по известному способу определяются антитела только одного изотипа.

Активность антител любого изотипа может быть четко оценена независимо от ее соотношения с активностью антител других иэотипов.

Предлагаемым и известным способами параллельно исследованы с иммуно1Р реагентами соответствующей специфичности сыворотки крови 24 больных с различными диагнозами. IgM антитела выявлены у 18 и 10 больных по предлагаемому и известному способам соответст15 венно (различие достоверно: P = 0,016) >

IgG антитела — у 21 и 5 больных (Ра, 10 ), IgA — у 14 и 2 больных (P

0,0007) . В целом антитела двух и трех иэотипов в одной сыворбтке об20 нарушены известным способом в 2 и 0 сыворотках соответственно, а предлагаемым — достоверно (P (0,008 ) чаще в 10 и 11 сыворотках. 0 том, что предлагаемый способ позволяет опреде—

25 лять антитела того или иного изотипа только при их наличии в пробе, свидетельствует, что в трех сыворотках антитела вообще не .были определены любым из двух способов.

30 Таким образом, предлагаемый способ позволяет повысить точность определения изотиповой принадлежности антител. р м у л а и з о б р е

Способ определения иэотипов анти1 тел путем приготовления нескольких серий исследуемых проб сыворотки, внесения в них специфических антител

4р к тяжелым цепям иммуноглобулинов классов А, G, Г1, инкубации смеси с последующей оценкой снижения титра антител, отличающийся тем, что, с целью повышения точности ф5 определения, в каждую исследуемую пробу вносят одновременно смесь антител к тяжелым цепям двух классов иммуноглобулинов, а инкубацию осуществляют в течение 1,5-2 ч с последующим

50 удалением иммунных комплексов.

1516981

Таблица 1

Специфичность антиглобулиновой сыворотки

Титр РПГА при разведении антиглобулиновой сыворотки

1:100

1:50

1: 200

Анти-, Анти — ) 250(4) 300(г),350(г) 300 (4) 200 (4)

175(2), 250(2)

200(2), 250(2) 350(2), 400(2)

250 (4) Анти- (300 (4) Контроль (без антиглобулиновой сыворотки) 500 (2), 600 (2) П р и м е ч а н и е. В скобках указано количество определений, l

Таблица 2

Обратный титр РПГА при экспозиции, мин

6Q 120

Температура при экспозиции, С

180 240

600(1)

700(3)

600(4) 500(4) 20

300 (1)

400 (3) 37

П р и м е ч а н и е. В скобках указано количество определений. таблица 3

Обратные титры РПГА по способу

Больные иэвестноиу предлагаеиоиу

Контроль После инактивации антител (Ig G Ig А

После инактивации антител хд с

Контроль

Ig А Ig И

48 84

48 96

72 96

72 96

20 320

40 240

Ф

Реакцию в калдои варианте выполняли двавды.

ФФ

В этих случаях титр реакции точно оценить невоэиокно

А — а )44

144

Д-)) 216

216

П вЂ” а 320

320

600(2)

800 (2)

600 (3)

700 (1)

400 (2)

500 (2) 48-1 44

48-96

96-216

96-216

320

144

l 44

216

192

320

144

144

192

192

600 (2)

700 (2)

500(2)

600 (2)

300 (1)

400(3) 144

) 44

216

2)6

320

144

)44

168

168

600(4)

500(4)

300(1)

40@(3) 400 (3)

500(1)

300 (1)

400(3)