Способ получения ферритинспецифичных антител
Изобретение относится к практической иммунохимии и иммунобиотехнологии и может быть использовано в медицинском иммунохимическом микроанализе . Цель изобретения - повышение стабильности целевого продукта. Поставленная цель достигается способом , включающим предварительное отделение протеиназ инкубапд1ен сыворотки крови иммунизированных животных с лизином, ковалентно связанным с активированной эпихлоргидрином сефарозой 4В, инкубацию супернатанта, полученного после отделения лизинсефарозы, с антигеном, ковалентно связанным с BrCN-aктиDИpoвaнIioй ссфарозой 4В, отмывку балластных белков буферными растворами нейтральных значений рН при варьировании ионной силы (хлористый натрий 0,2-1 М) и с добавлением детергента (0,3% твин-20) и элюцию антигенспещ фичньгх антител растворами с кислыми значега ями рН (рН 3 - элюция антител низкой аффинности , рН 2,3 - элюция высокоаффинных антител). Применение способа позволяет полностью исключить деструкцию препаратов ферритинспецифичных антител в процессе 30-дневного хранения , в то время как в препарате, полученном по способу-прототипу, до 80% антител в процессе хранения разрушается. г (Л СП о СП
СОЮЗ СОВЕТСНИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСГ1УБЛИН (51) 5 G 01 N 33/531.
ГОСУДАРСТ8ЕННЫЙ КОМИТЕТ
IlO ИЗОБРЕТЕНИЯМ И (ЛНРЫТИЯМ
ПРИ ГКНТ СССР
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ :К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (46) 07. 09. 91 . Бюл. Р 33, (21) 4237848/14 (22) 27.04.87 . (71) Институт биоорганической химии
AH БССР (72) С.П. Марцев, Г.И. Лепешева и Е.В. Гапеева (53) 615.373 (088.8) (56) Cowan S.I., Stagg В.Н., Niemann E.
The effect of variatious in the spe, cificities of the autibody components on à two-site immynoradiometrie assay for ferritin. In: Ra"
dio — immunoassay and related procedures in medicine. International
Atomic energy Agency, Vienna, 1978, р. 347-359. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРРИТИНСПЕЦИФИЧН6И АНТИТЕЛ (57) Изобретение относится к практической иммунохимии и иммунобиотехнологии и может быть использовано в медицинском иммунохимическом микроанализе. Цель изобретения — повышение стабильности целевого продукта.
Поставленная цель достигается спосоИзобретение относится к иммунохимии,а именно к способу получения антител, специфичных к ферритину.
Целью изобретения является повьппение стабильности антител, что позво-ляет их использовать в прикладной иммунобиотехнологии и в медицинском иммунохнмическом микроаналиэе.
Поставленная цель достигаетея с помощью предварительной инкубации ан„SU„,1505 > 95 А1
2 бом, включающим предварительное отделение протеиназ инкубацией сыворотки крови иммунизированных животных с лизином, ковалентно связанным с активированной эпихлоргидрином сефарозой 4В, инкубацию супернатапта, полученного после отделения лиэинсефароэы, с антигеном, ковалентно связанным с BrCN-активированвой сефа" розой 4В, отмывку балластных белков буферными растворами нейтральных значений рН при варьировании ионной силы (хлористый натрий 0,2-1 М) и с добавлением детергента (0,37. твин-20) и элюцию антигенспецифичных антител растворами с кислыми значениями рН g (pH 3 - элюция антител низкой аффинности, ри 2,3 — внюция високоаффин- (/) ных антител). Применение способа позволяет полностью исключить деструк- С, цию препаратов ферритинспецифичных антител в процессе 30-дневного хра- 2 нения, в то время как в препарате, полученном по способу-прототипу, до
80Х антител в процессе хранения раэ"< рушается. тисыворотки к ферритину с лизином, ковалентне связанным с сефарозой, и аффинной хроматографии на иммобилиэованном антигене, включающей удаление балластных белков буферами с нейтральным значением рН и последующую кислотную элюцию целевого продукта.
Пример 1.Получение ферритинспецифичных антител предлагаемьпм способом.
3 1505195
;«ч>«««»:луч. «к«««аффинного адсорбеH т «ф .р1.««ò««««селезенки человека имм >Г««:«иэуют на CNRr-ñ».ôëðoçå б»В, инкуб««рул CNHr-сефарозу 4В с ферр««ти»
5 ном 3 ч при кс мнатной температуре н рН 8, 3. Концентрация иммобилизованного феррити««л составляет 710 мг/мл уплотнен««oro геля.
Сыворотку крови кролика, содержащую антитела к селезоночному ферритину человека, получают путем иммунизации кролика мч раствора, состоящего из смеси 0,5 мл адъюнанта Фрейнда и 0,5 мл физиологического раствора,-содержащего 100 мкг ферритина из селез» ««к««»«еловека. Инъекции проводят с интервалом в одну неделю
3 раза, затем через 3 недели осуществляют четвертую инъекцию и спусти 20
10 суток начи««ают отбор крови у животных, Лизин-сефароэу получают, инкубирул н течение 2 ч при комнатной температуре 1 мл уплотненной актияиро- 25 ванной сефарозы 4R с 0,2 r L-лизина, растворенного в 1 мл 0,05 M карбонатного буфера с рН 8,9. Суспенэию лизин-сефароэы ««ентрифугируют 3 мин при 1500 g, осадок переводят в 0,1 М 30 натрий-фосфатный буфер с pFl 7,4 и повторно осажда«от. Концентрация иммобилизоканного лизина составляет
180-200 ««г/мл сефароэы.
К 0,5 мл уплотне«п«ой лизин-сефаро- 35 зы добавляют 3 мл сь«воротки крови кролика, содержащей антитела к селеэеночному ферритину человека,суспензию персме«««ина«от 20 мин при комнатной тм«пературе. Супернатант отделя- 40
» ют путем цеитрифугированил суспензии при 1500 g в течение 3 мин, затем смешивают его с 1 мл уплотненной ферритинсефарозы и добанплют 3 мл буфе.ра, сэдержащего 0,05 М трис-ИС1 и
0,2 M хлористого натрия, рН 8,0. После перемешинания н течение 1,5 ч при комнатно«1 температуре осадок ферри, тин-сефарозы отделяют центрифугироваФ иием при 1500 g в тече«н«е 3 мин и промывают посл едова тел ь но ? 0 объемами каждого из c««åäó«>ù«! х растворов: и) О, 05 M трис-НС1, рН 8 0 (буфер A), содержащий О, ? И х««» р««ст««й натрий, "S б) буфер А, с»>д»-ржащнй 1 М хлористый натрий, -я) буфер А, сод. ржащий 1 М хлористый нлгрнй и 0,3/ т>,«>; — 20, r ) б>у»1>».р»"> > с< >«« рж;l«l«««i«0, 2 M хлористый натрий.
Все г«ромывки и ««осле««ую«««ую элюцию проводят в Г>эч — варианте (т. е. иеремешиванием суспензии сорбента в объео ме pacr««opa) при температуре 0...2 С.
Осаждение ферритин-сефароэы проводят центрифугированием, как опись«валось вьппе. Эл«опию ниэкоаффинных антител проводят Я мл 0,05 М глицин-НС1 буфера, содержащего 0,2 М хлористого натрия, рН 3,0. Высокоаффинные антитела эл«оируют я 2 этапа 0,05 М глицин-НС1 буфером, рН 2,3, содержащим
0,2 М хлористый натрий (по 8 мл). рН полученного раствора доводят до
7,4 путем диализа против 0,1 M трис-НС1 буфера, содержащего 0,2 M хлористый натрий. Затем препарат ани тител лиофилпзуют и хранят при -18 С.
Получен««ый таким образом препарат при электро!>орезе в 77-ном полиакриламидном геле характеризовался одной белковой полосой, соответствующей мол.м. приблизительно 160 кДа.
При гель-хроматографии на TSK-геле
HW-60 Г получен один симметричный пик с мол.м. приблиэительно 160 кДа.
Гель-ф««льтрацил препарата на TSK-геле
HW-60 f после его хранения в течение
4 месяцев при t-18 С дала один симметричный пик беэ появления видимого
;количества ниэкомолекулярных примесей.
Получение феррити««специфичнь«х антител по способу-прототипу.
При электрофорезе в 7Х полиакриламидном геле препараты содержали одну белковую полосу, соответстнующую мол .м. 160 кДа.
При гель-хроматографии на.TSK-геле HM-60 f препарата антител непосредственно после их выделения получен один симметричный пик с мол.м. приблизительно 160 кДа, Гель-хроматография препарата на
TSK-геле после его хранения в тече«н«е 4 месяцев показала, что в препарате сохраняется лишь около 207. белка с мол.м. 160 кДа при появлении низкомолекулярных примесей, составляющих 80К от исходного количества белка. Это доказывает нестабильность полученных по способ>у-прототипу антител, что выражается н накоплении большого количества фрагментов антител при исчезновении нативных иммуноглобулинов с мол.м. 160 кДа.
<1<
> — Ii! < << Гт и с т а !1 о в 1 I « Г < It< « It < I)l .!I .I< I < it < . Ei . < !, ! . !(T l» P O r) 1 1! !< > > t t; > < ; 1; 1 Т . < H<)Jff»POr,1 lt! E 1.»атогр.)<1 <»!1 tl<1 т!>(,"- ": 1: ;l, -< !) i !<(с.— и ч р а т (() е >> и i I I 1» < е I l I !c I! (I X: I l t I < I T " .< i П«ЛУ< -,, ° Тll<< ft<><.— JIå . гo хр; "« «!», " ., ва<<н(>>: > виде l!plf — 18 <; l: т<, »г о i,:ч;tl« реxроматогр1<)! руlпт fl(. ); . г I<(Н(<-60 f . 3;»т !". попуч .Ei!i! !с 1 ра кц!<и 1!<.— Г! ОЛ !АЗУ« T P 71 !! 111» ф < P P Т i t . «; f I !! « ;; "! t I, . Р <1 (Т В О— ре 00 f,ft(f / I )атеl" !<;<.»t ° t.! !<) 10(< l.»JI 25 фракций, пол; Ioftf:! :: 1:« ..«1 < Jll ((рс— Мс»ТОI Р афнi! !E>> 1»ЛР;IТ 1
0,03 м!(Е»! !!;1 1!робирку.,<((»л!. « < е ОПРЕДЕ7»еинС f!РОН >;!! Ках П;! 1!!(30 в при (.ре 2 ° (!олученц((в» -lloi 1менте отнош .нис связали<- c сорб< 1том радиоактивно<-.т!! к обп<ей j),! Jtèoактивности, внес енн< I . I) flp((>ирку (В/Т) Jfo фр t t;Itl»J м,;!-ок;! 3ывас)т отсут35 СТВИ С П !IT!I ГЕ!»C Pi1 !113 ЛЮГ»еl I C IIO(. i>t>!IOC ти у коротких ffel)TI»zttt:;.; <1>p П р и и е р 4. ((с»!сль1((ание цнгиби Topoâ протеиl»а.) для стай)илизац»»и препарат;1 антител, It< "., «н!»ог< по способу-прототипу. Антигенспецифич гн !е « ilтнтела получают с помощью способа-проготипа. После доводе!п»я рН до 7,4 к диализованному препарату, да!пшел»у при гельхроматографии на TSK-геле H(> -60 f один симл!етричн!и» пик, добавляют ингибиторы протеиназ: фегп!лметилсульфонилфторид в конечной концентрации 0,5 мМ, Я -аминокапроновую кислоту 5р в ко» е ой конце нтра ц3»и и (, эЛ в конечной концентрации 20 мМ. Затем препарат хранят при 4 С. Полученные данные показывают, что использование таких ингибиторов протецназ, 55 как фенилл»етилсульфо1»3»лфторид, F. -ами" нокапроновая кислота, Э)(ТА, It<. позволяет достичь цели изобрете!и!я получить cTабилизирос)анны»» 11реп1рат антигенспецифичных антител, лишен () ) I (1 > l(р и л» е p . . Опр< лел(ни» 7
1 полученных г!редвагаел»л»м и контрол!— ным способом. с Полученные способ(м с использова— »с3!ем объекта изобретения и контрольным способом антитела иодируют по методу, обеспечивакппему наиболее >l
»25 ГРЛЬ XPOMBTOI фией íà TSKгеле Н1(60 f и хранят в лиофилизованном lf <25 хранения I-ìå÷(3èt få антитела используют в ил»мунорадиометри<»ескол! определении ферритина. Пля этого в пробирки вносят ферритин в количеcTве от 0,2 до 25.нг на пробирку, !то соответствует концентрации ферритина в исходном растворе от 5 до 500 мкг/л .Затем добавля!от 100 мкл ферритинспецифичных антител, меченых изотопом иод-125 (по 0,03-0,08 мкКи нли 5-18 нг антител) и 100 мкл ;),05 t(натрий-фосфатного буфера,со-! ержащего 17. БС<< и 0,2% азида нат>ия. После инкуба»п»и в течение 3 ч (ри комнатной температуре в пробирки добавляют 100 мкл 10%-ной (вес/объем) .:успензии иммуносорбента, садержаще о антитела к селезеночному ферриту, ммобилизованные на микрокристалли1еской целлюлозе, и встряхивают 1 ч »ри комнатной температуре. Затем сус1ензию центрифугирую! 15 мин при "000 g, осадки промывают 2 мл дистиллированной воды и повторно осам-! ают. В полученных осадках опредеяяют скорость счета радионуклида I C5 I, отражающую колич ес тво свя занньж с иммуносорбентом комплексов 1)ерритина со специфическими антите-. лами. Использование предлагаемого способа позволяет получать антитела, антигенсвязывающие свойства которых не изменяются за период хранения 30. суток. В то же время получение антител контрольным способом дает антитела, антиг енс вя эывающие с войс тва которых за этот же промежуток времени существенно снижаются: уменьшаются значения В /Т. Отношение связанной с сорбентом радиоактивности к общей радиоактивности при концентрации ферритина 500 мкг/л снижается с 63 до 43Х различия величины В/Т в Составитель Н. Калинин Техред М.Дидык Корректор Т. Палий Редактор Л. Павлова Заказ 3723 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного коиитета по изобретениям н открытиям прн ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Рауюская наб., д. 4/5 Производственно-п.3датспьскнй комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина, 101 7 1505tO5 6 ный протеолитической фрагментации Формула иэобретениМ нативных антител. Короткие ептид ные фрагменты антител не обладают Способ полученйя ферритинспеци- (как было показано в прийере 3) ай- фичных антител путей проведенИя 5 тигенсвяэывающей активностью и яв- хроматографии иммунной сыворотки нв ляются "балластным" материалом. В ферритине,коввлентно свяэайном с то ае время предлагаемый способ в сефароэой, о т.л и ч в ю шийся сравнении с п поэволяет тем, что, с целью ловыюения стабиль предохранить получаемые ферритииспе" ности целевого продукта, перед хроцнфичные антителв от деструкции е матографией иммунную сыворотку обпроцессе хранения. рвбатывают лизин-сефароэой.
