Способ получения эхинококкового диагностического антигена для иммуноферментного анализа

 

Изобретение относится к ветеринарии , точнее к иммунологической диагностике лавральных форм гельминтов , а именно эхинококков. Цель изобретения - повьшение чувствительности и специфичности иммуноферментного анализа. Для этого неустойчивые компоненты эхинококковой жидкости Изобретение относится к ветеринарии , в частности к иммунологической диагностике лавральньк форм гельминтов, а именно эхинококков. Может быть использовано для той же цели в медицине при эхинококкозе человека . Целью изобретения является повышение чувствительности и специфичности иммуноферментного анализа. Пример 1. Проводят сбор жидкости из эхинококковых пузырей зараженных овец, затем проводят ее концентрирование в 60 раз (вначале на овец в процессе ее концентрирования, замораживания i и оттаивания, хранения при (-20°С) выпадают в осадок и удаляются центрифугированием, а устойчивые клетки, сохраняющие растворимость , освобождают от примеси компонентов невысокой молекулярной массы (Kq ОТ 0,35 до 1,0) гель-фильтрацией на сефадексё от 6-50 до 6-200. Из оставшихся высокомолекулярных фракций с КдуО-0,35 дополнительно удаляют неспецифические примеси на анионообменнике ДЕАЕ-сефадексе А-50 при концентрации злюента 0-0,25 М, затем элюируют специфический материал повьппением концентрации элюента с 0,25 до 0,40 М. Полученньй препарат не. содержит мешающих проведению иммуноферментной реакции перекрестно-реагирующих антигенов, может быть использован в качестве диагностикума при эхинококкозе сельскохозяйственных животных и человека. с (Л лиофильной установке до 10-кратного уменьшения объема, а затем в целлофане против сухого полиэтиленгликоля с молекулярной массой 40000). Полученный концентрат замораживают и хранят до использования при -20 С. В процессе концентрирования и хранения некоторые неустойчивые компоненты эхинококковой жидкости денатурируются и вьшадают в осадок. После размораживания концентрат центрифугируют в течение 15 мин при 10000 об/мин, осадок отбрасывают, а супернатант фракционируют на колонке (3 см х 80 см) с со Ф 00 СП Од 4

СВОЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК i v i li h 8

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А ВТОРСНОМЪ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 3876312/28-14 (22) 02.04.85 (46) 30.07.89. Бюл. У 28 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт гельминтологии им.К.И.Скрябина (72) В.В.Клименко, С.Н.Белозеров и Н.В.Шеховцов (53) 615;373 (088..8) (56) J.limnology, 1966, V 96, N- 5, рр.814-821 (прототип) . (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭХИНОКОККОВОГО

ДИАГНОСТИЧЕСКОГО АНТИГЕНА ДЛЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА (57) Изобретение относится к ветеринарии, точнее к иммунологической диагностике лавральных форм гельминтов, а именно эхинококков. Цель изобретения — повьппение чувствительности и специфичности иммуноферментного анализа. Для этого неустойчивые компоненты эхинококковой жидкости

Изобретение относится к ветеринарии, в частности к иммунологической диагностике лавральных форм гельминтов, а именно эхинококков.

Может быть использовано для той же цели в медицине при эхинококкозе человека.

Целью изобретения является повышение чувствительности и специфичности иммуноферментного анализа.

П р и м"е р 1. Проводят сбор жидкости из эхинококковых пузырей зараженных овец, затем проводят ее концентрирование в 60 раз (вначале на

„„SU„„1363564 А 1

< 1> 4 А 61 К 39/00, G 01 N 33/53

2 овец в процессе ее концентрирования, замораживания (и оттаивания, хранения при (-20 С) выпадают в осадок и удаляются центрифугированием, а устойчивые клетки, сохраняющие растворимость, освобождают от примеси компонентов невысокой молекулярной массы (К от 0,35 до 1,0) гель-фильтрацией на сефадексе от 6-50 до 6-200. Из оставшихся высокомолекулярных фракций с К 0-0,35 дополнительно удаляют неспецифические примеси на анионообменнике ДЕАЕ-сефадексе А-50 при концентрации элюента 0-0,25 М, затем элюируют специфический материал новьппением концентрации элюента с 0,25 до 0,40 M. Полученный препарат не содержит мешающих проведению иммуноферментной реакции перекрестно-реагирующих антигенов, может быть использован в качестве диагностикума при эхинококкозе сельскохозяйствен-, ных животных и человека. лиофильной установке до 10-кратного уменьшения объема, а затем в целлофане против сухого полиэтиленгликоля с молекулярной массой 40000). Полученный концентрат замораживают и храо нят до использования при -20 С ° В процессе концентрирования и хранения некоторые неустойчивые компоненты эхинококковой жидкости денатурируются и выпадают в осадок. После размораживания концентрат центрифугируют в течение 15 мин при 10000 об/мин, осадок отбрасывают, а супернатант фракционируют на колонке (3 см х 80 см) с

3 13635

550 мл геля сефадекса Г--200, уравновешенной 0,05 М трис-НСI-буфером с добавлением 0,3 М КС1 (рН 8,2). На поверхность геля наносят да 20 мл образца и элюируют тем же буфером со скоростью 15 мл/ч. К моменту появления н элюате первых порций белка (после выхода примерно 150 мп с начала элюции) включают хроматографиче- 10 ский коллектор, отрегулированный FM

40-минутные интервалы времени„ H собирают фракции объемом по 10 мл, После сбора 70 фоа1<ций элюцию прекращают. Из каждой фракции отбирают об- 15 разцы по 0,2 мл„ разбавляют их н

3 мл воды и фотаметрируют при 280 нм на спектрофотамере. Затем строят rpaQFII< элюции, откладывая по горизонтали обьемы элюата (Ve) в мл, а по верти- 29 кали — результаты фотометрирования (процент светопропускания, Т /.), Иммунологическую активность исходного концентрата и каждой фракции определяют реакций иычунодиффузии с ис- 25 пользованием активных иммунпых сывороток, полученных от зараженных или иммунизированных животных или от лю" дей больных эхинокакказом, Результаты реакции (титры антигенов) тажке 30 отражают на графике.

Иммунологически активные компоненты эхинококковой жид;<ости распределяются во фракциях, объемы элюпии которых (V ) находятся н пределах . r э

200-400 мп, что соответствует величине коэффициента распределения от О до 35 (рассчитано по формуле

Чв -Ч

К = — —.. где V — общий объем геля а Ч -Е, В кОлОнки Че Объем элюдии или Объем выхода данной фракции; V — свободный объем геля; К вЂ” величина постоянная для данной колонки, поэтому с учетом этой величины нужные фракции прн исПОльзавании ОднОЙ кОлОнки мОгут быть отобраны даже без предварительного определения их антигенпой активности) .

Фракции, в которых обнаружена ан50 тигенная активность (К<, от О до

О, 35), объединяют, остальные фракции

Кщот 0,35 до 1,0) отбрасывают.

Дальнейшую очис тку пр о водят ме тодом ионообменной хроматографии на

ДЕЛЕ-сефадексе А-50. Для этого 2 г сухого анионообменника суспендируют в течение суток,в 0,01 M трис-НС1буфера (рН 8,,2). Разбухший гель про64 мынают на фильтре последовательно

О, 5 М ИаС1,, водой, О, 5 М NaOH, водой, 0,5 М ИаС1 и, наконец, стартовым буферам (0,01 М трис — НС1, рН 8,2).

Подготовленный гель упаковывают в хроматаграфическую колонку (2 см Х

15 см), имеющую 30 мл геля, и уравновешивают ее стартоным буфером, Концентрированный пул, полученный при гель-фильтрации высокомолекулярных фракций (К<, .0-0.,4) с содержанием белка 6-7 мг/мл обессоливают посредством диализа против стартового буфера. Быстрее можно обессолить материал па колонке с сефадексом Г-25, уравновешенной стартовым буфером.

20 мл обессоленного образца наносят на понерхчость анианообменника, покрытую диском фильтранальной бумаги (лучше испсльзовать колонку, имеющую адаптор, облегчающий нанесение образца) и элюируют с использованием ступенчатого градиента концентрации хлористого натрия, растворенного в стартовом буфере, Объемы каждого элюента должнь быть не менее 80 мл, С примечением 5 ступеней градиента концентрации соли собирают свыше 100 фракций объемами по 3 мл. Каждую фракцпю фотометрируют при 280 нм и строят график элюции.

Фракции, соответствующие пикам оптической плотности, объединяют в пулы„концентрируют до исходного объема (до объема который имел образец до фракционирования) и исследуют их антигенную активность.

Каждая из б пулов в реакции имму— надиффузии с сыворотками людей, больньг эхинококкозам, обладал определенной антигенной активностью,. причем в некоторых пулах найдены различающиеся, в некоторых — одинаковые антигенные компоненты и число их в разных пулах различно.

Небольшую активность проявляют пу— лы 4,и 5, элюируемые соответственно н диапазоне концентрации хлористого натрия 0,2-0,3 M и 0,3-0,4 M. По результатам иммунодиффузии эти фракции негомогенны и включают до 3 антигенных компонентов, выявляемых разными сыворотками, причем в антигенном отношении пулы 4 и 5 почти не различа- . ются. При их анализ,е иммуноферментным методом с использованием сывороток свиней с экспериментальным эхинакоккозом также показана наибольшая

1363564 чувствительность (100%) и специфичность (92-94 ) фракций 4 и 5, причем более специфична из них фракция 5 (94 ) .

Таким образ ом, результаты иммуно—

5 ферментной реакции при эхинококкозе свиней показывают, что фракции, элюируемые при концентрации соли не выше

0,2 М, являются непригодными в качестве диагностикумов, тогда как фракции, элюируемые в диапазоне концентрации соли О, 2-0, 4 M обладают высокой чувствительностью и специфичностью, особенно фракция 5 (О, 3-0, 4 М) .

Фракции 4 и 5, полученные при высоких концентрациях элюента (О, 2

0,4 M) при длительном хранении в замороженном состоянии устойчивы, не дают осадка и не теряют активности, Все 6 фракций испытаны при эхинококкозе свиней спустя 2 месяца после их получения. Следует отметить, что материал, из которого получены испытанные антигеннь»е препараты, до очист25 ки и на разных этапах очистки хранил Ъ ся в замороженном состоянии (-20 С) в целом в течение 2 лет.

Пример 2. Предварительные этапы получения антигена те же, что и в примере 1, но при гель-фильтрации используют сефадекс Г-50.

Разбухший гель объемом 240 мл упаковывают в колонку (3 см Х 50 см), уравновешивают ее пропусканием О, О 1 М 3 трис-HCt. — 6óôåðà,содержащего 0,2 М

NaC1 (pH 8,2), наносят 20 мл концентрата эхинококковой жидкости с содержанием белка 15,5 мг/мл и элируют со скоростью 60 мл/ч. После выхода 80 мл 40 элюата включают коллектор и собирают фракции объемами по 7 мл. После сбора

30 фракций элюцию прекращают, отбирают образцы элюата по 0,1 мл, разбавляют их в 3 мл воды и фотометрируют 45 при 280 нм. Результаты опыта выражают графически.

Фракции, соответствующие первому пику (К»„ от О до 0,35) и проявившие антигенную активность с образованием нескольких полос преципитации в реакции иммунодиффузии с сыворотками людей, больных .эхинококкозом; и с сь»воротк ой кролика, иммунизированного эхинококковой жидкостью, объединяют в один пул, объем которого составляет около 50 мл. Остальные фракции отбрасывают.

Дальнейшую очистку антигенов проводят на анионообменнике ДЕАЕ-сефадексе A-50 (объем геля в колонке 45 мл, образец 50 мл пула фракций, полученных на сефадексе Г-50) .

В качестве стартового буфера используют О, 01 М трис-НС 1 с добавлением 0,2 М NaC1 то есть берут такую концентрацию, при которой, согласно примеру 1, элюируется фракция 3.

Вместе с ней естественно будут элюированы и фракции 1 2, что значительно сокращает объем работы.

В примере 1 было показано, что фракция 4, элюируемая в диапазоне

0,2-0,3 М, по спец»»фичности в иммуноферментной реакции несколько уступает фракции 5 (0,3-0,4 М), хотя по результатам иммунодиффузионного анализа обе фракции в антигенном отношении близки. По-видимому, более низкая специфичность фракция 4 обусловлена присутствием в ней компонентов смежной, менее специфичной фракции (О, 1 О 2 М), от которых можно о во бодиться, применив промежуточную ступень градиента концентрации соли, а именно О, 25 М, Для элюции специфического материала можно использовать, как и ранее, ступени градиента 0,3 М и 0,4 М.

Полученные в этом опыте фракции, соответствующие пикам оптической плотности или ступеням градиента, были объединены в 5 пулов (1-3, 4а, 46, 5, б). Каждый пул был сконцентрирован до такого объема, который имел образец до фракционирования, и подвергнут иммунохимическому анализу в реакции иммунодиффузии с использованием сывороток людей, больных эхинококкозом. Иммуногенные для человека эхинококковые антигены обнаружены во всех пулах, причем в некоторых пулах присутствуют как одинаковые, так и различающиеся компоненты, причем наиболее близкими в антигенном отношении оказались фракции 46 и 5.

При анализе фракций в реакции иммунодиффузии с сывороткой кролика, содержащей антитела к глобулинам (преимущественно, к иммуноглобулинам) овечьей сыворотки, показано присутствие иммуноглобулинов овцы во фракциях, элюируемых при концентрации соли до 0,25 M то есть во фракциях

1-3 и 4 а. Во.фракциях 46 (0,25-0,30

1363564

M) и 5 (0,30-0,40 М) они практически отсутствуют.

Диск-электрофорез в полиакриламидном геле показал, что основная масса

1 сывороточного альбумина, присутствующего в овечьей эхинококковой жидкости, попадает во фракцию 4а (О, 200,25 М), во фракции 4б обнаружены лишь его следы. Этот же метод показал 10 практическое отсутствие во фракции 4б и глобулинов хозяина, присутствовавших в суммарной фракции 4 и оказавшихся после ее дополнительного разделения во фракции 4а. l5

Присутствие белков хозяина в антигенных препаратах может быть источником специфических реакций лри диагностике эхинококкоза с помощью иммуноферментного метода, принцип которо" 20 го основан на взаимодействии испытуемой сыворотки с антивидовым конъюгатом. Как упоминалось в примере

1, для. получения антигенов используют жицкость из эхинококковых пузырей. 25 овец, в которой обычно присутствуют сывороточные белки овцы. Иммунохимический анализ подтвердил их присутствие в концентрате эхинококковой жидкости и во фракциях, элюируемых при концентрации соли до 0,25 М.

Испытание фракции 5 (0,3-0,4 М) в качестве диагностикума в иммуноферментной реакции при эхинококкозе овец в контрольных опытах на возможность взаимодействия конъюгата с ком35 понентами диагностического антигена (в отсутствии испытуемой сыворотки) дало отрицательные результаты. Таким образом, показанное иммунодиффузион40 ным методом отсутствие во фракции 5 белков овцы, с которыми мог бы взаимодействовать конъюгат, подтверждено иммуноферментным методом.

Испытания показали, что при эхинококкозе овец фракция 5 не уступает антигенам, полученным из эхинококко-. вой жидкости человека и естественно не содержащим мешающих реакции иммуноглобулинов„ овцы. Более того, она превосходит их по чувствительности.

Если чувствительность цельной эхинококковой жидкости человека при эхинококкозе овец достигала 78,87., а антигена, осажденного сернокислым аммонием из эхинококковой жидкости человека, 96,37, то чувствительность фракции 5 была 1007-ной.

При необходимости адсорбцию антигенов на анионообменнике можно проводить без колонки, промывая носитель элюентом на фильтре °

Таким образом, наиболее чувствительным и специфичным диагностикумом в иммуноферментной реакции при эхинококкозе является часть полученной путем гельфильтрации высокомолекулярной фракции эхинококковой жидкости, которая состоит из высокозаряженных компонентов и десорбируется с анионообменника в диапазоне концентрации соли 0,25-0,4 М.

Рекомендуемые согласно известному способу фракции, десорбируемые при концентрации элюента не выше 0,2 М, в иммуноферментной реакции обладают на 8-25Х более низкой чувствительностью и на 4-67. более низкой специфичностью из-за присутствия белков хозяина и перекрестно-реагирующих антигенов паразитарного происхождения, устойчивые компоненты, обуславливающие неспецифичность фракций, элюируемых при концентрации соли до 0,2 M не способны обеспечить достаточную чувствительность этих фракций, что делает их в диагностическом отношении неперспективными.

Положительный эффект достигается тем, что антигенный препарат, полученный в диапазоне концентрации соли

0,25-0,40 М, обладает высокой устойчивостью. Он практически не теряет активности при хранении в замороженном состоянии до 2 лет (срок наблюдения). Кроме того, чувствительность эхинококковой жидкости человека при эхинококкозе овец достигает 78,8Х, а антигена, осажденного сернокислым аммонием из эхинококковой жидкости . человека, 96,37, в то время как чувствительность данного диагностикума

1007.

B полученном данным способом препарате практически не содержится белков хозяина (овцы), поэтому он может быть применен в качестве универсального диагностикума при эхинококкозе любых животных и человека.

Формула из обретения

Способ получения эхинококкового диагностического антигена для иммуноферментного анализа, включающий сбор жидкости из эхинококковых пузырей зараженных овец, ее концентрирование, замораживание — оттаивание и фракциСоставитель Л.Падюков

Техред Л.Олийнык Корректор В.Гирняк

Редактор Т.Пилипенко

Заказ 4908 Тираж 644 Подписное

BHHHIIH Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101

9 13635 онирование комбинаций гель-фильтрации на сефадексе (от Г-50 до Г-200) и ионообменной хроматографии на ДЕАЕсефадексе А-50 о т л и ч а ю щ и й—

5 с я тем, что, с целью повышения чувствительности и специфичности иммунного анализа, размороженный препарат центрифугируют, осадок отбрасывают, надосадочную жидкость фракционируют, 10

64 10 причем при гель-фильтрации собирают и объединяют все иммунологически активные фракции с коэффициентом распределения от 0 до 0,35, а при ионообменной хроматографии удаляют белки, элюируемые 0,25 М раствором соли, и за-. тем в препарат антигена объединяют фракции, элюируемые в интервале 750f50000 концентраций соли 0,25-0,40 М.