Способ количественного определения углеводородов в биологических объектах

 

Изобретение относится к пищевой и микробиологической промьшшенности и может быть использовано для определения углеводородов в пищевых продуктах и продуктах микробиологического анализа. Целью изобретения является расширение возможностей способа путем определения различных классов углеводородов, а именно алифатических и циклоалифатических углеводородов , моноциклических ароматических и бициклических ароматических углеводородов, а также трициклических ароматических и полицпклических ароматических углеводородов.Берут образец биоматериала, разрушают ег о щелочным гидролизом, неомыляемые липиды экстрагируют неполярным растворителем , затем подвергают хроматографическому разделению на колонке с активированным силикагелем. При этом выделяют две фракции: первую элюируют гексаном, вторую - смесью гексана и диэтилового эфира (9:1). Для концентрирования полициклических ароматических углеводородов и отделения переходных примесей проводят жидкость-жидкостное распределение 2-й группы соединений в системе диметилформамид - вода - гексан (9:1:10) и последующее хроматографическое разделение выделенной смеси н тонком слое ацетилированной целлюлозы (система - этанол - ацетон - вода 60:25:15). Хроматографическое разделение 1 фракции проводят в тонком слое окиси алюминия с выделением зон, содержащих алифатические и циклоалифатические углеводороды, моноциклические арены, бицикличейкие арены. Идентификацию и количественное определение выделенных соединений проводят с помощью газожидкостной и УФ-спектрофотометрии. 4 табл. (Л ОС 00 О5 4

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

„„SU„„ iÇÇÏß

А1 (51) 4 G 0) N 33/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (2)) 3777444/28-)3 (22) 06.08.84 (46) 15.09.87. Бюл. Ф 34 (71) Институт питания AMH СССР (72) Т.M.Óøàêîâà, Л.Ш,Воробьева и О.Н.Чернышева (53) 637.523 (088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

17573), кл. С 12 Q )964.

Авторское свидетельство СССР

N9 175728, кл, С 12 Q 1/00, 1964.

Grimmer G., S,Н ° Bohnke,Environmental carcingens selected methods

of anolysis. Egan ТАКС publication

lyon, 1979, v.3, ed.4, р.129. (54) СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ УГЛЕВОДОРОДОВ В БИОЛОГИЧЕСКИХ

ОБЪЕКТАХ (57) Изобретение относится к пище-. вой и микробиологической промьш)пенности и может быть использовано для определения углеводородов в пищевых продуктах и продуктах микробиологического анализа ° Целью изобретения является расширение возможностей способа путем определения различных классов углеводородов, а именно алифатических и циклоалифатических углеводородов, моноциклических ароматических и бициклических ароматических углеводородов, а также трициклических ароматических и полициклических ароматических углеводородов.Берут образец биоматериала, разрушают его щелочным гидролизом, неомыляемые липиды экстрагируют неполярным растворителем, затем подвергают хроматографическому разделению на колонке с активированным силикагелем. При этом выделяют две фракции: первую элюируют гексаном, вторую — смесью гексана и диэтилового эфира (9:1), Для концентрирования полициклических ароматических углеводородов и отделения переходных примесей проводят жидкость-жидкостное распределенгге 2-й гругпы соединений в системе диметилформамид — вода — гексан (9:1:!О) и последующее хроматографическое разделение выделенной смеси в тонком слое ацетилированной целлюлозы (система этанол — ацетон — вода 60:25:15) .

Хроматографическое разделение l фракции проводят в тонком слое окиси алюминия с выделением зон, содержащих алифатические и циклоалифатические углеводороды, моноциклические арены, бицикличеСкие арены. Идентификацию и количественное определение выделенных соединений проводят с помощью гаэожидкостной и УФ-спектрофотометрии, 4 табл °

1337764

Изобретение относится к пищевой и микробиологической промышленности и может быть использовано для определения углеводородов в пищевых проI) дуктах и продуктах микробиологического синтеза °

Целью изобретения является расширение возможностей способа путем определения различных классов углеводородов, а именно алифатических и циклоалифатических углеводородов, моноциклических ароматических и бициклических ароматических углеводородов, а также трициклических ароматических и полициклических ароматических углеводородов, Способ осуществляют следующим образом.

Исследуемый образец биоматериала разрушают с помощью щелочного гидролиза, неомыляемые липиды экстрагируют неполярным растворителем и подвер25 гают хроматографическому разделению на колонке, заполненной активированным силикагелем, выделяя при этом две фракции: первую элюируют гексаном — она содержит алифатические и циклоалифатические углеводороды, моно- и бициклические ароматические углеводороды (арены); вторую фракцию элюируют смесью гексана и диэтиловогo эфира (9::1) — она содержит трии полициклические арены, а также ряд 35 природных соединений, затрудняющих определение аренов, в том числе сквален (природные смеси), Для того, чтобы сконцентрировать полициклические ароматические углеводороды (IIAY) и 4" отделить природные примеси, проводят жидкость-жидкостное распределение

2-группы соединений в системе диметилформамид (ДМФ) — вода — гексан (9

1 : 10) и последующее хроматогра- 45 фическое разделение выделенной смеси в тонком слое ацетилированной целлюлозы (система — этанол — ацетон

I вода 60: 25: 15) . Хроматографическое разделение 1-й фракции проводят в тон- 50 ком слое окиси алюминия, выделяя зоны, содержащие алифатические и циклоалифатические углеводороды, моноциклические арены, бициклические арены.

Идентификацию и количественное определение выделенных соединений проводят с помощью газожидкостной (ГХ) и УФ-спектрофотометрии.

Пример 1. Определение модельной смеси углеводородов, добавленной к свиному салу е

К образцу сала (200г) добавляют модельную смесь соединений (см. табл.l). Материал гидролиэуют в

600 мл 1,5N раствора КОН в смеси этанол: вода (9:1) в течение 3-х ч при кипении рас ра. Неомыляемые липиды экстрагирую. з реакционной массы гексаном (Зх150 мл) после разбавления ее 600 мл воды, Экстракт промывают водой, сушат сульфатом натрия и упаривают до объема 1-2 мл.

Хроматографическое разделение экстракта проводят на колонке, заполненной 15 г силикагеля, предварительно промытого хлороформом и ако тивированного при 200 С в течение

4 ч. Элюируют первую фракцию 80 мл гексана, вторую фракцию — 100 мл смеси гексана и диэтилового эфира (9:1) .

Первую фракцию подвергают хроматографическому разделению в тонком слое окиси алюминия 1-й степени активности в системе гексан на стеклянных пластинах 20х20 см. Проявляют хроматографические эоны в парах иода.

Собирают зоны алифатических и циклоалифатических углеводородов (R 0,9

1,0), моноциклических аренов (R 0,70,8), бициклических аренов (R 0,5

0,6) .

Для того, чтобы устранить возможные ошибки, связанные с колебаниями хроматографической подвижности исследуемых углеводородов, с края хроматографической пластины наносят в точку смесь реперных соединений (н-алкан, гептадецилбензол, нафталин), отделяя эту часть пластины сплошной полосой, Фракции элюируют с сорбента смесью гексана и диэтилового эфира, растворитель упаривают, выделенные соединения анализируют с помощью ГХ.

Вторую фракцию, в состав которой входят три- и полициклические арены, а также ряд природных соединений, в том числе сквален, упаривают досуха, растворяют в 100 мл гексана и экстрагируют трижды смесью Д1Ф вЂ” вода (9:1) по 100 мл. ДМФ-слой разбавляют 300 мл воды и экстрагируют гексаном (3 х х 100 мл). Экстракт промывают водой и сушат сульфатом натрия, растворитель упаривают до 1-2 мл, Хроматогра фируют экстракт в тонком слое ацетилированной (307) целлюлозы в хрома1337764 тографической системе этанол — ацетон — вода (60: 25: 15) на пластине

13х 18 см. Хроматографические эоны обнаруживают при облучении пластины

УФ-светом (Ъ-360 нм) по их флуоресценции, Используют также реперные соединения фенантрен, бенз(а)антрацен, бенз (р) хризен, бенз (Е) пирен) .

Собирают соответствующие зоны и анализируют фракции с помощью ГХ.

Условия ГХ:стеклянный капилляр (1 = 50 м, d = 0,25 мм) OV-10), пламенно-ионизационный детектор (ПИД), газ-носитель — азот, скорость

1 2 мл/мин, программирование темпераФ о туры от 150 до 300 С со скоростью

3 /мин, Результаты определения модельной смеси углеводородов, добавленной к образцу свиного сала, по способу-прототипу и предлагаемому способу приведены в табл.1.

Как видно из приведенного сравнения, изобретение обеспечивает выделение и определение соединений как алифатического, так и ароматического рядов, включая ПАУ. В то же время способ-прототип позволяет определить только ПАУ с числом циклов 4 и более, трициклические арены (фенантрен) определяются не количественно (выделено 307).

Пример 2. Модельную смесь углеводородов, включающую 10 мг эйкозана, 5 мг гептадецилбензола, 5 мг диметилнафталина, 2 мг фенантрена,.

2 мг бенэ(а)антрацена, 2 мг бенз(е)пирена и 2 мг бенз()хризена, растворяют в !00 мл гексана и экстрагируют 100 мл смеси ДМФ вЂ” вода (9:1).

ДМФ-слой разбавляют водой (1:1) и экстрагируют 100 мл гексана.

Гексановый экстракт промывают Но дой, упаривают до объема 500 мл и анализируют с помощью ГХ на стеклянном капилляре с OV-101, детектор—

ПИД при программировании температуо ры от 150 до 300 /мин, газ-носитель азот, скорость 1,2 мл/мин.

Результаты примера 2 приведены в табл.2.

Иэ табл.2 видно, что распределение в бинарной системе ДМФ-Н О /гексан позволяет достаточно селективно разделить алифатические и полициклические углеводороды с числом циклов

4 и более. Для аренов с числом циклов 1-2 это распределение значительно менее селективно и связано с потерями анализируемых соединений как в гексановом, так и в ДМФ-слое. Очевидно; что переэкстракция неомыляемых липидов, проводимая в способепрототипе перед хроматографическим разделением последней, приводит к потерям моно- и бициклических аренов и не дает возможности количественного их определения. В то же время жидкость-жидкостное распределение в этой системе позволяет отделить от

ПАУ ряд природных соединений, совпадающих с ними по хроматографической подвижности, и является существенным этапом в выделении и концентрировании три- и полициклических аренов. Поэтому эта стадия введена в предлагаемую схему анализа после хроматографического выделения из неомыляемых липидов суммы алифатических, циклоалифатических, моно- и бициклических ароматических углеводородов.

Пример 3 ° Определение углеводородного состава тканей крыс, в корм которых добавляли дизельное топливо (ДТ) в количестве 50 и 400 мг/кг массы животного °

Согласно предлагаемому способу определяют основные компоненты дизельного топлива в тканях крыс контрольной и опытных групп. Определение алифатических и циклоалифатических углеводородов осуществляют с помощью

ГХ по методу внутреннего стандарта °

Условия ГХ описаны в примере 1. Результаты определения аренов получены на основании анализа УФ-спектров растворов соответствующих фракций.

В табл. 3 и 4 представлены полученные данные о содержании алифатических, циклоалифатических и ароматических углеводородов в тканях крыс контрольной и опытных групп.

Разработанные условия колоночной хроматографии позволяют селективно разделить укаэанные две группы соединений, а также отделить от первой группы углеводородов природный полиеновый изопреноид — сквален, присутствие которого затрудняет определение бициклических аренов.

Как показали предварительные эксперименты, четкое отделение скваленв достигается только при использовании активированного (полностью обезвожен1337764

25 ного) при 200 С силикагеля. Элюирование фракций последовательно гексаном и смесью гексана и диэтилового эфира (9:1) обеспечивает минимальное перекрывание хроматографических зон первой и второй фракций, что позволяет избежать потерь определяемых соединений и повысить точность анализа.

Соотношение гексана и диэтилового эфира 9:1 (по объему) является оптимальным и обеспечивает полноту элюирования полициклических аренов с числом конденсированных циклов до 7 и в то же время приводит к минимальному загрязнению второй фракции природны1 ми примесями. Иеньшее количество диэтилового эфира в смеси значительно повышает объем элюата, большее приводит к перегрузке выделенной фракции примесями, что затрудняет последушщее xpoMaòîãðàôè÷åñêoå ее разделение в тонком слое ацетилированной целлюлозы.

Проведение хроматографического разделения. первой фракции в тонком слое окиси алюминия позволяет вьделить сумму алифатических и циклоалифатических углеводородов, а также отдельно моно- и бициклические арены.

Жидкость-жидкостное распределение второй группы соединений в системе ДИФ вЂ” вода/ гексан дает возможность значительно сконцентрировать следовые количества три- и полициклических аренов и отделить ряд примесей природного характера, мешающих их дальнейшему определению. Трехкратная переэкстракция в системе д."1Ф— вода/гексан значительно увеличивает степень извлечения ПАУ.

Тонкослойная хроматография (ТСК) на ацетилированной целлюлозе, полученной выше смеси соединений, позволяет выделить узкие фракции три- и полициклических аренов и в то же время отделить следовые примеси неуглеводородного характера, Применение реперных соединений при ТСХ обеспечивает четкое выделение исследуемых групп углеводородов и устраняет возможные ошибки, связанные с изменением хроматографической подвижности этих соединений, Изобретение дает возможность расширить возможности способа путем определения различных классов углеводородов, позволяет достигнуть полно30

55 ты извлечения исследуемых углеводородов, высокой селективности разделения их на группы, а также произвести достаточно полное отделение примесей природного характера, что позволяет с большой точностью и надежностью определять следовые количества алифатических, циклоалифатических и ароматических соединений, дифференцировать смеси природных углеводородов и загрязняющих биоматериал нефтяных углеводородов.

Изобретение не требует дефицитного оборудования и материалов и может быть использовано в лаборатории химического и биохимического профиля при анализе различных биологических объектов, в частности при гигиенической характеристике продуктов питания и продуктов микробиологического синтеза для определения загрязнения их углеводородами нефти, Ф о р м у л а и з о б р е т е н и я

I Способ количественного определения углеводородов в биологических объектах, включающий отбор образца, гидролиз водно-спиртовым раствором щелочи, экстракцию неомыляемых липидов, жидкость-жидкостное их распределение в системе диметилформамид вода — гексам, колоночную хроматографию на силикагеле, выделение углеводородов с количественным определением последних, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью расширения возможностей способа путем определения различных классов углеводородов, колоночную хроматографию проводят перед жидкость-жидкостным распределением, причем для хроматографии используют активированный силикагель и выделяют две фракции, первую нз которых элюируют гексаном, вторую— смесью гексана и диэтилового эфира в объемном соотношении 9:1, а жидкость-жидкостному распределению подвергают вторую фракцию, при этом выделение углеводородов из любой фракции проводят с помощью тонкослойной хроматографии.

2. Способ по п.1, о т л и ч а юшийся тем, что алифатические и циклоалифатические углеводороды, моноциклические ароматические и бициклические ароматические углеводороды выделяют раздельно из первой фрак1337764 ции, при этом тонкослойную хроматографию проводят на окиси алюминия, трициклические ароматические и полициклические ароматические углеводороТаблица 1

Выделено

Соединение

Добавлено к образцу, мг по способу-пропо предлагаемому способу тотипу мг Х мг

9,70 97

10,00

Эйкозан

Гептадецилбензол

l,85

2,0

Диме тилнафталин

1,82

2,00 30

0,95

0,30

1,00

Фенантрен

Бенз (o) антрацен

0,47

0,43

0,5

0,46

0,46

Бенэ(а)хризен

Бенэ(е)пирен

0,5

0,48

90

0,45

0 5

Таблица 2

Соединение

Взято на Выделено, Степень экстрак- мг иэвлечецию, мг ния, Х

О,!

Эккозан

Гептадецилбенэол

0,4

1,2

24,0

1,3

1,6

197

I 8

Диметилнафталин

Фенантрен

Бенэ(а)антрацен

Бенз(а)хриэен

Бенз(е)пирен ды вьщеляют раздельно иэ второй фракции, при этом тонкослойную xpoMa гографию проводят на ацетилированной целлюлозе, 1 337764

Таблица

Содержание алнфатических н цнклоалнфатнческнх углеводородов в органах и тканях крыс, получавших нефтяные днстиллаты (дизельное топливо) с кормом (в мг/кг массы бноматернала) Лоза нефтяных днстипла. тов 400 мг/кг о за нефтяных дистиллатов

50 мг/кг

Контроль

Образ биома риала

Состав Фракции

УВ, Х

С умма

УВ

Состав фракции

УВ, 7

Сумма

УВ умма Состав фракглево- ции УВ, Х ородов

yS) С „-C„С„-C„ !

С, -С аг С1>-С»

См и Са>

Жировая ткань

40 2 57 5 42 5 298 0 91,9

68,9 33,2 66,8 128,4 60,9

8,1

24!2,0

153,3

Печень

39,1

Мозги 17,3 59,5 40,5

IS,I 70,3

29,7

20,4

Почки

I0,O 62,9 37>l 11,7 78>7

6,6 66,7 33 3 71,0 89,0

21,3

84,4

Легкие

ll,0

248,5

Таблица 4

Содержание аренов

Образец биомабициклических те риала моноциклических трициклических

Добавка ДТ, мг/кг

50 400

Добавка ДТ, мг/кг

50 400

Добавка ДТ, мг/кг

50 400

Жировая ткань

23> 90 52,6

2,1

10,0

0,6

2,3

7,4

Печень

0,05

0,04

Почки

5,5

0,10

4,4

Мозги

Составитель И.Кутукова

Техред И.Попович

Редактор Е.Копча

Корректор В>Бутяга

Заказ 4123/41

Производственно-полиграфическое предприятие, г.ужгород, ул.Проектная, 4

Содержание ароматических углеводородов нефтяных дистиллатов (ДТ) в тканях крыс (в мг/кг биомате риала) Тираж 776 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб » д ° 4/5

92,8 7,2

72,8 21,2

85,2 !4,8

80,8 19,7

90,3 9,7