Способ определения молочной кислоты в биологических жидкостях
Изобретение относится к медицине . Цель изобретения - повышение точности способа. Смешивают раствор сульфосалициловой кислоты и исследуемую биологическую жидкость и центрифугируют . Супернатант помещают в водяную .баню, смешивают с рабочим реактивом и нагревают.Полученную смесь смешивают с раствором параоксидифенила,прогревают , охлаждают и фотометрируют. Количество молочной кислоты в опытной пробе высчитывают с учетом оптической плотности эталонной пробы с известной концентрацией молочной кислоты.2 табл. 00 со ел 00 00
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАИИСТИЧЕСНИХ
РЕСПУБЛИН (19) (ll) А1
yl) 4 G 01 N 33/66
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ,13
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ CCCP
flO ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3906693/28-14 (22) 06.06.85 (46) 07.09,87. Бюл. Ф 33 (71) Белорусский научно-исследова-. тельский институт охраны материнства и детства (72) В.Ю. Домбровский и В,П, Панферов (53) 616.7(088.8) (56) Руководство по клиническим лабораторным исследованиям.. M., 1964, с. 294. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МОЛОЧНОЙ КИС-.
ЛОТЫ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ (57) Изобретение относится к медицине, Цель изобретения — повышение точности способа. Смешивают раствор сульфосалициловой кислоты и исследуемую биологическую жидкость и центрифугируют. Супернатант помещают в водяную .баню, смешивают с рабочим реактивом и нагревают. Полученную смесь смешивают с раствором параоксидифенила, прогревают, охлаждают и фотометрируют. Количество молочной кислоты в опытной пробе высчитывают с учетом оптической плотности эталонной пробы с известной концентрацией молочной кислоты.2 табл.
I 1335880 2
Изобретение относится к биологии и медицине и может быть использовано в клинической лабораторной диагностике.
Цель изобретения — повышение точности способа за счет внесения в супернатант соляно-кислого семикарбазида.
Способ осуществляется следующим )p образом, Применяют реактивы: 0,229 моль/л (57) водный раствор сульфосалициловой кислоты; серная кислота для пробы Са валя; 0,500 моль/л (12,57) водный 16 раствор серно-кислой пятиводной меди)", 0,179 моль/л (27) водный раствор с.оляно-кислого семикарбазида.
Рабочий реактив получают следующим образом. К 99,0 мл серной кислоты для 20 прсбы Саваля добавляют 0,6 мл
0,500 моль/.л раствора серно-кислой меди, перемешивают и добавляют 0,4 мл
0,179 моль,/л раствора соляно-кислого семпкароазида. Перемешивают и ставят ?б а в водяную баню с температурой 70 С на 30 мин, после чего реактив вынимают из бани и охлаждают до комнатной темперагуры.
Кроме того, применяют 0,088 моль/л 30 (1,5i) раствор параоксидифенила в диметилформамиде.
В пробирку наливают 0.,4 мл
0,229 моль/л раствора сульфосалициловой кислоты, вносят в нее 0,02 мл цельной крови (плазмы крови, сыворотки крови, спинно-мозговой жидкости), тщательно перемешивают и через 10 мин центрифугируют в течение 10 мин при
3000 об./мин. 0,3 мл супернатанта пе- 40 реносят в другую пробирку, которую помещают в холодную водяную баню с темо пературой воды 5-15 С, после чего в нее добавляют 2,6 мл рабочего реактива, тщательно перемешивают и прогревают в водяной бане с температурой о воды 70 С в течение 10 мин. Пробирку охлаждают водопроводной водой,,цобавляют в нее 0,05 мл 0,088 моль/л раствора параоксидифенила, тщательно перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 60 мин, Пробу вновь прогревают в водяной
D бане с температурой воды 70 С в течение 4 мин, охлаждают водопроводной водой до комнатной температуры и фотометрируют на спектрофотометре при
570 нм против контроля на реактивы в кювете с толщиной рабочего слоя
10 Mhi ° Контрольную пробу обрабатывают так же, как и опытную, но вместо исследуемой биологической жидкости используют дистиллированную воду в том же объеме.
Количество молочной кислоты в опытной пробе высчитывают с учетом оптической плотности эталонной пробы с известной концентрацией молочной кислоты, которую также проводят через всю методику, Расчет ведут по формуле
-эт где С и С вЂ” концентрации молочной
an кислоты в опытной и эта онной пробах соствстственно;
Е и Е, — оптические плотности
all опытной и эталонной пробы соответственно.
Повьппение точности определения молочной кислоты по предлагаемому способу по сравнению с известным способом подтверждается при экспериментальком исследовании растворов молочной кислоты с концентрациями 0,555;
1,110 и 2„220 ммоль/л,цельной крови, плазмы крови и с.пинно-мозговой жидкости, результаты которого представлены в табл. 1, Проводят по 5 параллельных определений каждой пробы, Сравнительный анализ результатов статистической обработки величин оптической плотности цветного продукта реакции при определении .молочной кислоты по предлагаемому и известному способам показывает, что в ;-.ервом случае при больпем значении средней арифметической (М) величины средней ошибки средней арифметической (ш) и среднеквадратического отклонения (б ) значительно ниже, чем при определении молочной кислоть.. по известному способу, что свидетельствует о большей точности предлагаемого способа.
П р и и е р 1. Определение молочной кислоты проводят в отдельных пробах цельной крови, плазмы крови,сыворотки крови, спинно-мозговой жидкости и эталонного раствора молочной кислоты, причем из каждой пробы делают по три параллельных определения и рассчитывали M„ m и б
В шестна,ццать пробирок наливают по 0,4 мл 0,229 моль/л раствора сульфосалициловой кислоты и вносят в пробирки 1-3 по 0,02 мл цельной кро1335880 ви, в пробирки 4-6 0,02 мл плазмы крови, в пробирки 7-9 0,02 мл сыворотки крови, в пробирки 10-12 0,02 мл спинно-мозговой жидкости в пробирки ь
13-!5 0,02 мл эталонного раствора молочной кислоты с концентрацией
1 ммоль/л в пробирку 16 0,02 мл дистиллированной воды (контроль на реактивы), Пробы тщательно перемешивают и через 10 мин центрифугируют в течение
10 мин при 3000 об/мин. 0,3 мл супернатанта из каждой пробирки переносят в другие пробирки с соответствующими номерами, которые помещают в водяную баню с температурой воды 5-15 С,после чего в них добавляют по 2.,6 мл рабочего реактива Гс испо:и зоваппем
0,6 мл 0,480 моль/л сег,но-кислой цятиводной меди + 0,4 мл 0,170 моль/л соляно-кислой семикарбазида + серной кислоты для пробы Саваля до 100).
Пробы тщательно перемешивают и прогревают в водяной бане с температу- 2В рой воды /О С в течение 10 мин, после чего охлаждают водопроводной водой, добавляют в них по 0,05 мл
0,088 моль/л раствора параоксидифенила, тщательно перемешивают и остав- g0 ляют при комнатной температуре на
60 мин, Затем пробы вновь прогревают в водяной бане с температурой воды о
70 С в течение 4 мин, охлаждают водопроводной водой до комнатной темпера35 туры и фотометрируют опытные и эталонную пробы на спектрофотометре при
570 нм против контроля на реактивы.
Количество молочной кислоты в опыт-<< ных пробах высчитывают по формуле (1)
Получают следующие Результаты измерения оптической плотности опытных и эталонных проб Еоо, = 0,187; Ео„
Средняя Е „,, = 0,230. По Формуле О (1) рассчитывают концентрацию молочной кислоты в опытных пробах
0 813 ммоль/л;
С, = 0,800 ммоль/л;
С„,э = 0,808 ммоль/л.
Таким образом, для пробы цельной крови
М = 0,807; тп = +0,0046;
С = 0,0065.
0,978 ммоль/л;
0,987 ммоль/л; — 0,969 ммоль/л.
Соп
СО 5
С„, Для пробы плазмы крови
М = 0,978; п7 — +0,0063;
0,0090. — 1 . 1 65 MMOJTb/ U
l, 156 ммоль/л;
1,148 ммоль/л, 0П7 pnS
Con 9
Для пробы сыворотки крови
1сб
+0 0060
0,0085.
1,595 ммоль/л;
1,578 ммоль/л; — 1,587 ммоль/л. бы спинно-мозговой жидкости
m,0
Can
Con Для про N = 1,586; m = +0,0060; 6 = 0,0085. С „ = 0,818 ммоль/л; В тех же образцах цельной крови, плазмы крови, сыворотки крови и спинно-мозговой жидкости (по три параллельных определения из каждой пробы) способом, описанным в примере 1, но с использовавием рабочего реактива с максимальными значениями концентраций меди сернокислой пятиводной и семикарбазида солянокислого (0,6 мл 0,520 моль/л серно-кислой пятиводной меди + 0,4 мл С,201 моль/л солянокислого семикарбазида + серная кислота для пробы Саваля до 100,0 мл), определяют кочичество молочной кислоты. Получают следующие практические результаты измерения оптической плотности опытных и эталонной проб: E „< pnz y 8 j Eppes Fpn7 (сыворотка кРови) = 0,268; Е „8 По формуле (1) рассчитывают концентрацию молочной кислоты в опытных . пробах 1335880 Таким образом, для пробы цельной крови 0,810; +Оь0047ь 0,0066. 0,965 ммоль/л; 0,974 ммоль/л; 0,978 ммоль/л. ОП4 Соп Caï6 15 ммоль/л; ммоль/ль ммоль/ле 1,160 1, 169 — 1, 15.1 опт опт anal 9 Для пробы сыворотки крови М = 1,160, m = +0 0063; Б = 0,009. 25 l,588 ммоль/л; 1,575 ммоль/л; 0,575 ммоль/л, 0gp ig = Con „ оп Для пробы спинно-мозговой жидкости М = 1,579," ш = +0,0053; (з = 0,0075. 0,17-0,20 Результаты определения молочной 35 кислоты в одних и тех же пробах биолоДо 100 Таблица 1 Оптическая плотность по способу Исследуемый материал По предлагаемому способу Раствор молочной кислоты 0,125 0,130 Оь127 0,131 0,128 О,?60 0,257 0,258 0,254 0,255 Оь070 M = 0,079 0,128 0,090 0,060 m = +0,0067 +0,0011 0,0024 Оь555 ммоль/л 0,095 G = 0,0149 Оь080 0,163 0,192 М = 0,174 То же, ,110 ммоль/л 0,257 +0,0011 0,0024 Оь 1 ФО 0,200 0,174 m = +0,0115 0,0257 С„„ = 0,809 ммоль/л; С„„ = 0,805 ммоль/л. Для пробы плазмы крови М = 0;972; m = +Оь0047; C) = 0,0066. гических жидкостей с использованием рабочего реактива с минимальными и максимальными значениями концентраций серно-кислой пятиводной меди и солянокислого семикарбазида представлены в табл. 2. Сравнительный анализ с использованием статистическсй обработки не выявил различий между ними. Формула изобретения Способ определения молочной кислоты в биологических жидкостях путем добавления в пробу химического реактива, центрифугирования полученной смеси с последующим внесением в супернатант раствора серно-кислой пятиводной меди и серной кислоты. для пробы Саваля, нагревания, а затем охлаждения и добавления в пробу раствора параоксидифенила, после чего проводят спектрофотометрическое измерение, о т л и ч а ю ш, и и с я тем, что, с целью повышения точности способа, в супернатант дополнительно вносят соляно-кислый семикарбазид в смеси с реактивами при следующем соотношении компонентов, моль/л: Серно-кислая пятиводная медь 0,48-0,52 Семикарбазид солянокислый Серная кислота для пробы Саваля По известному способу 1335880 Продолжение табл,1 Оптическая плотность по способу Исследуемый материал По предлагаемому способу По известному способу 0,512 M = 0,514 0,330 0,370 0,354 0,302 0,333 То же, 2,220 ммоль/л +О, 0135 0,0302 +0,00 13 0,0029 0,310 0,068 М = 0,091 0,158 Цельная кровь 0,073 0,102 0,117 +0,0094 0,0210 +0,0011 0,0024 0,094 0,158 М = 0,161 0,247 Плазма крови 0,192 0,137 0,178 +0,0108 0,0237 . +0 0012 0,0026 О, 143 0,210 М = 0,219 0,436 Спинно-мозговая жидкость 0,190 0,265 0 234 0,196 m = +0,0144 +0,0026 0,0058 0,0322 Т а б л и ц а 2 Концентрация молочной кислоты (M+m) при использовании рабочего реактива,ммоль/л,с значениями концентраций меди сернокислой пятиводной и семикарбазида соляно-кислого Биологическая жидПроба кость (t = 0,45) - 0,1 (t = 0,76) r 0,1 0,807+0,0046 0,810+0,0047 1-3 Цельная кровь 0,978+0,0063 0,972+0,0047 4-6 Плазма крови 1,156+0,0060 1,160+0,0063 (t = 0,46) > 0,1 7-9 Сыворотка крови (t = 0,87) О,1 1, 586+0,0060 1, 579+0, 0053 10-12 Спинно-мозговая жипкость 0,517 0.515 0,513 0,516 0,160 О, 157 0,155 0,160 0,161 0,245 0,248 0,250 0,247 0,246 0,435 0,433 0,439 0,440 0,437 минимальными максимальными,