Способ разделения смеси фитогормонов

 

Изобретение относится к области биологии, в частности к выделению растительных гормонов. Целью изобретения является повышение точности и расширение возможностей способа. Способ заключается в том, что лиофилизированный биологический материал экстрагируют метиловым спиртом.Растверитель отгоняют. Водный раствор центрифугируют, очищают толуолом и доводят рН раствора до 9-10 добавлением раствора щелочи. Из раствора сначала удаляют жирные кислоты,аминокислоты , пигменты, катионы и др. соединения на колонке окиси алюминия, затем осаждают белковые вещества концентрированным раствором уксуснокислого свинца, центрифугируют, добавляют к центрифугату 10%-ный сульфат натрия до полного удаления катионов свинца и снова центрифугируют. Центрифугат подкисляют 5 н.НС до рН 2- 2,5 и фитогормоны извлекают 2-3 раза равными объемами (1:1) очищенного а серного эфира. Затем проводят хроматографию на адсорбенте. Фитогормоны проявляют путем опрыскивания раствором флуоресцеина с последующим воздействием парами брома и освещением ультрафиолетовым светом. 1 табл. (Л 00 00 СП 00 го

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН (50 4 С 01 N 33 48

1 д .

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ .ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ.(61) 11 64598 (22) 4005164/28-13 (22) 29. 1.1. 85 (46) 07.09.87. Бюл. ¹ 33 (75) И.И. Гаврилюк (53) 612.396.1(089 8) (56) Романова Л.В. Труды по прикладной ботанике, генетике и селекции.

ВНИИР им, Н.И. Вавилова, Л., 1978, вып. 3, т.61, с. 134-139.

Авторское свидетельство СССР

¹ 1164598, кл, G 01 N 33/48, 1983. (54) СПОСОБ РАЗДЕЛЕНИЯ СМЕСИ ФИТОГОРМОНОВ (57) Изобретение относится к области биологии, в частности к выделению растительных гормонов. Целью изобретения является повышение точности и расширение возможностей способа.

Способ заключается в том, что лиофилизированный биологический материал экстрагируют метиловым спиртом.Раст-! воритель отгоняют. Водный раствор центрифугируют, очищают толуолом и доводят рН раствора до 9 — 10 добавлением раствора щелочи. Из раствора сначала удаляют жирные кислоты,аминокислоты, пигменты, катионы и др. соединения на колонке окиси алюминия, затем осаждают белковые вещества концентрированным раствором уксусно кислого свинца, центрифугируют, добавляют к центрифугату 10Х-ный сульфат натрия до полного удаления катионов свинца и снова центрифугируют, Центрифугат подкисляют 5 н.НС1 до рН 22,5 и фитогормоны извлекают 2-3 раза равными объемами (1:1) очищенного серного эфира. Затем проводят хроматографию на адсорбенте. Фитогормоны проявляют путем опрыскивания раствором флуоресцеина с последующим воздействием парами брома и освещением ультрафиолетовым светом. 1 табл.

1335879

Изобретение относится к биологии, в частности к выделению растительных гормонов (гибберелловой, индолилуксусной кислот, цитокининов) и являет> 5 ся усовершенствованием способа по авт.св. II 1164598.

Цель изобретения — пов1ш ение точности и расширение возможности способа. 10

Ранее не были известны способы извлечения фитогормонов из материалов животных организмов.

Способ осуществляют следующим образом. 15

Лиофилизированный биологический материап экстрагируют охлажденным до о

-5-7 С подкисленным 807-ным метиловым спиртом (0,5 мл 0,1 н, НС1 на 100 мл спирта) при -5-7 С в течение 62-63 ч. 20

Спиртовой экстракт взбалтывают на качалке в течение 3 ч при комнатной температуре, после чего продолжают экстракцию при охлаждении еще 18 ч. о

Центрифугируют экстракт при 0 С (при 25

5000 об,/мин в течение 5-10 мин с последующим повторным центрифугированием со свежей порцией растворителя.

Растворитель отгоняют под струей воздуха от вентиляторов ° 30

Водный раствор центрифугируют при комнатной температуре при 5000 o6/мин в течение 15-20 мин, очищают толуолом и доводят рН раствора до 9-10 добавлением раствора щелочи (20Š†н NaOH)

Из раствора сначала удаляют жирные кислоты, аминокислоты, Пигменты, катионы и другие соединения на колонке с окисью алюминия, затем осаждают белковые вещества концентрированным 4О раствором уксусно-кислого свинца, центрифугируют 10 мин при 5000 об./мин„ добавляют к центрифугату 10Х-ный сульфат натрия до полного удаления катионов свинца и снова центрифугируют.

Центрифугат подкисляют 5 н. НС1 до рН 2-2,5 и фитогормоны извлекают

2-3 раза равными объемами (1:1) очиценного серного эфира. Объединенные зытяжки cepHGI О эфира упаривяют В токе воздуха досуха, остаток растворяют в 2 мл этилового спирта и хроматографируют в тонком слое адсорбента в

=оответствии с основным способом.

II р и M е р 1. 5 г лиофилизированкого луба виноградной лозы экстрагируют подкисленным 80Х-ным метиловым пиртом (0,3 л, 62 ч) при температуре -7 С (в холодильнике). Спиртовой экстракт взбалтывают на механической качалке при комнатной температуре в течение 3 ч и снова выдерживают 18 ч о при -7 С. После центрифугирования при о

=0 С (5000 об ° /мин в течение 40 мин) спиртовой экстракт отделяют, а осадок размешивают в 40 мл растворителя и центрифугируют 10 мин при тех же условиях. Объединенные экстракты отгоняют под струей воздуха от вентиляторов. Водный раствор (=80 мл) центрифугируют при комнатной температуре (5000 об./мин в течение 20 мин). К центрифугату добавляют равный объем толуола, встряхивают, декантируют и удаляют верхний слой. Эту операцию повторяют дважды.

Реакцию раствора,цо рН 9 доводят

202-ной NaOH, наносят ка колонку с окисью алюминия, элюируют водой. Из

100 мл элюата белки осаждают концентрированным раствором уксусно †кисло свинца центрифу Гир юг (10 мин IIpH

5000 об,/мин), к центрифугату добавляют 10К-пый сульфат натрия до полного удаления катионов свинца и снова центрифугируют. Водный остаток подкисляют до рН 2 с помощью 5 н. НС1 трижды фракционируют с равными объемами (1:1) очищенным серным эфиром.

Эфирные фракции кислых соединении упаривают досуха, остаток растворяют в 2 мл 96Z — ного этипового спирта и хроматографируют фитогормоны в соответствии с основным способом.

В качестве хроматографического слоя применяют смесь целлюлозы, сефадекса С-25, силикагеля с люминесцентным индикатором УФ „ и крахмала при массовом соотношении 63:15:14:8. Сефадекс, силикагель, крахмал и целлюлозу последовательно в отдельности суспендируют в деионизированной воде (на

15 r смеси 60 .мл воды). После суспендирования каждого компонента смеси суспензию размешивают 1 мин. Указанное количество адсорбента достаточно для приготовления десяти пластинок.

Для приготовления пластинок со слоем комбинированного адсорбента используют стекляные, тщательно обезжиренные фотопластины (?3,7х8,7 см).

Полученную сорбционную массу наливают на пластинки и сушат в строго горизонтальном положении на воздухе не менее 3 ч, что обеспечивает получение слоя 100 мкм, Пластинки активио руют при 90 С в течение 15 ч. Хрома1335879 матограммах сильно поглощают ультрафиолетовый свет и принимают темнофиолетовую окраску.

Значения R фитогормонов на комби1

40 нированном адсорбенте приведены в таблице.

R х100 (Раство1 ритель: н-бутанол, пропанол,аммиак, 45 вода 28: 57: 5: 10, об. Е) Соединение

Кинетин

Индолилуксусная кислота

Гибберелловая кислота

Абсцизовая кислота

51 тографию фитогормонов проводят при о

20 С. Растворы наносят микрошприцем.

Для хроматографирования фитогормонов используют подкисленный 80Х-ный водный этанольный раствор (из расчета

0,5 мл НС1 на 10 мл спирта). На пластинку наносят пробы различных количеств смеси по 1-3 мкл раствора, содержащего 17-64,5 мкг фитогормонов, После нанесения растворов стартовую линию подсушивают феном в течение

2-3 мин.

Хроматографию проводят в герметической стеклянной камере размером

150х150х200 мм. Расход растворителя составляет 80 мл, Для разделения кинетина, индолилуксусной, гибберелловой и абсцизовой кислот подобрана систе— ма растворителей " бутанол. Пропанол9 20 аммиак, вода в объемном соотношении

28:57:5:10.

Систему растворителей пропускают восходящим током при подъеме ее на

21 см от линии старта. Разделение фитогормонов на комбинированном адсорбенте происходит за 2,5 ч. Хроматограмму подсушивают феном и выветривают до исчезновения запаха растворителя ° Для качественного определения фитогормонов используют комбинированный проявитель. Слой опрыскивают

0,005Х-ным водным раствором флуоресцеина, сушат 2 мин феном, действуют парами брома, освещают ультрафиолетовым светом. Фитогормоны на таких хроПример 2. 1О мл сыворотки крови человека фиксируют жидким азотом и растирают до порошкообразного состояния, экстрагируют 400 мл подкисленного 807.-ного метилового спирта о

60 ч при -5 С. После взбалтывания спиртового экстракта на механической о качалке при 22 С в течение 3,5 ч снова выдерживают 18 ч при низкой температуре. Экстракт центрифугируют при

0 С (5000 об./мин в течение 35 мин), отделяют спиртовой экстракт и осадок размешивают в 40 мл подкисленного метилового спирта и центрифугируют

10 мин при той же температуре.

Объединенные спиртовые экстракты отгоняют в -аке воздуха и оставшиеся

115 мл водного раствора центрифугируют при 20, (5000 о6./ìèí в течение

20 мин). I(центрифугату добавляют

120 мл толуола, встряхивают 3 мин и декантируют. Промывку со свежей порцией толуола повторяют еще раз. Доводят реакцию раствора до рН 10 207-ной

Na0H пропускают через колонку с окисью алюминия и элюируют 25 мл во— ды. Белки из 140 мл элюата осаждают

15 MJI концентрированного раствора уксусно-кислого свинца, центрифугируют

15 мин при 5000 об,/мин и к центрифугату добавляют 13 мл 107-ного сульфата натрия.

Водный остаток подкисляют до рН

2,5 с помощью 5 н.НС1 (рН раствора проверяют с помощью универсальной индикаторной бумаги) и фракционируют не менее трех раз равными объемами очищенного серного эфира. Эфир удаляют в токе холодного воздуха, а сухой остаток растворяют в 2 мл 967 †но спирта. Спиртовой раствор фильтруют через стеклянную вату и хроматографируют по примеру 1.

Пример 3. 30 мл бычьей спермы фиксируют жидким азотом и растирают до порошкообразного состояния, экстрагируют 400 мл подкисленного

807-ного метилового спирта 60 ч при

-6 С. После взбалтывания спиртового о экстракта при 22 С в течение 3,5 ч снова выдерживают 18 ч при низкой температуре. Экстракт центрифугируют при 0 С (5000 об,/мин в течение 40 мин), осадок размешивают в 40 мл растворителя и центрифугируют 10 мин при тех же условиях.

Объединенные спиртовые экстракты отгоняют в токе воздуха и оставшиеся ны как из растительного, так и из животного сырья в большем количестве по сравнению с известным способом

5 и значительно с экономить органи— ческие растворители этилацетат толуол) .

Формула изобретения

Составитель И. Тареева

Техред В.Кадар

Корректор И. Иуска

Редактор П, Гереши

Заказ 4042/38

Тираж 776 Подписное

БНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 13035,, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие,г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Я 13358

120 мл водного раствора центрифугируют при 20 С (5000 об,/мин в течение

20 мин). Трижды промывают центрифугат равными объемами толуола. Доводят реакцию раствора до рН 9,5 207-ным раствором Na0H пропускают через колонку с окисью алюминия и элюируют

25 мл воды.

Белки из 140 мл элюата осаждают

20 мл концентрированного раствора уксусно-кислого свинца, центрифуги.руют 20 мин при 5000 об./мин и к центрифугату добавляют 15 мл 10Х-ного сульфата натрия, Зодный остаток 15 подкисляют до рН 2,25 с помощью 5 н, HCl. Экстракт доводят до хроматографированпя по примера 1 и 2, Таким Образом, предлагаемый способ дает Возможность Выделить фитОГopMQ 20

Способ разделения смеси фитогормонов по авт.св. Ф 11б4598, о т л и— ч а ю шийся тем, что, с целью повышения точности и расширения возможностей способа, перед нанесением смеси на адсорбент, экстракт подщелачивают до рН 9-10, добавляют раствор уксусно-кислого свинца, нодкисляют до рН 2-2,5 и экстрагируют серным эфиром.