Способ определения специфического аллергена при атопической бронхиальной астме

 

Изобретение относится к иммунологии . Цель изобретения - повышение точности способа. Готовят среду для измерения хемилюминесценции и исслед,уемый аллерген. Из гепаринизированной крови больного выделяют мононуклеарные клетки. Измеряют хемилгоминесценцию в суспензии мононуклеарных клеток . После достижения максимума спонтанной хемилюминесценции добавляют сыворотку больного с образовавшимися иммунными комплексами и определяют максимум интенсивности свечения.Для контроля измеряют хемилюминесценцию суспензии мононуклеарных клеток,при добавлении аутологичной сывЬротки без аллергена, аллергена без сыворотки и сыворотки с неспецифическим аллергеном . За пороговое значение хемилюминесцентного ответа мононуклеарных клеток, активизированных иммунным комплексом, принимают увеличение интенсивности свечения не менее чем в 6 раз по сравнению со спонтанной хемилюминесценцией и не менее чем в 3 раза по сравнению с контролем (при добавлении сыворотки с неспецифическим аллергеном). (Л 00 со ел 00 00

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) (11) (51) 4 С 01 N 33 48 п1

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

C (0

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3963241/28-14 (22) 16.07.85 (46) 07.09,87. Бюл. № 33 (71) 2-й Московский государственный медицинский институт им. Н.И. Пирогова (72) А.Г. Чучалин, Е,Б. Величковская и Л.Г. Коркина (53) 615.375(088.8) (56) Авторское свидетельство СССР № 1197640, кл. G 01 N 33/48, 24.12.84. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СПЕЦИФИЧЕСКОГО АЛЛЕРГЕНА ПРИ АТОПИЧЕСКОЙ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМЕ (57) Изобретение относится к иммунологии. Цель изобретения — повышение точности способа. Готовят среду для измерения хемилюминесценции и исследуемый аллерген. Из гепаринизированной крови больного выделяют мононуклеарные клетки. Измеряют хемилюминесценцию в суспензии мононуклеарных кле- . ток. После достижения максимума спонтанной хемилюминесценции добавляют сыворотку больного с образовавшимися иммунными комплексами и определяют максимум интенсивности свечения.Для контроля измеряют хемилюминесценцию суспензии мононуклеарных клеток,при добавлении аутологичной сыворотки без аллергена, аллергена без сыворотки и сыворотки с неспецифическим аллергеном. За пороговое значение хемилюминесцентного ответа мононуклеарных клеток, активизированных иммунным комплексом, принимают увеличение интенсивности свечения не менее чем в

6 раз по сравнению со спонтанной хемилюминесценцией и не менее чем в 3 раза по сравнению с контролем (при добавлении сыворотки с неспецифическим аллергеном).

13358

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для диагностики атопической бронхиальной астмы.

Цель изобретения — повышение точности способа эа счет определения аллергена в составе циркулирующих иммунных комплексов на мононуклеарных клетках методом люминолзависи- ið мой хемилюминесценции клеток.

Способ осуществляется следующим образом, Готовят среду для измерения хемилюминесценции, содержащую, мМ: NaC1

110; трис-НС1 10; глюкозу 7,65; МдС1, 2,5 и люминол 0,65. Последний добавляют в среду для усиления хемилюминесценции.

Готовят исследуемый аллерген путем разведения стандартных растворов коммерческих пылевых и пыльцевых аллергенов в 57.-ном растворе глюкозы в соотношении 1:1000. Конечная концентрация пыльцевых аллергенов 25

SpIIU/ìë, пылевых аллергенов 10pNU/ìë, Выделяют мононуклеарные клетки из гепаринизированной крови больного (5 мл крови, 0,1 гепарина) центрифугированием на одноступенчатом гради- gp енте фиколла-верографина плотностью

1,077 г/см при 400 g a течение 40 мин с последующим трехкратным отмыванием средой - 199 по 10 мин. Конечная концентрация клеток составляет (1,5-2,0)»

6 -! 35

10 мл

Получают сыворотку больного из

5 мл негепаринизированной крови центрифугированием при 200 g в течение

10 мин.

Формируют иммунные комплексы путем добавления в 100 мкл сыворотки больного ?О мкл разведенного аллергена.

Измеряют хемилюминесценцию в 50 мкл суспензии мононуклеарчых клеток боль45 ного при введении ее в измерительную кювету прибора, содержащую 800 мкл среды, После достижения максимума спонтанной хемилюминесценции и выхода кривой интенсивности свечения на плато в кювету добавляют 20 мкл сыворотки больного с образовавшимися иммунными комплексами и определяют максимум интенсивности свечения активированных мононуклеарных клеток, В качестве контроля проводят измерение хемилюминесценции суспензии мононуклеарнь1х клеток того же больного при добавлении аутологичной сыво1

78

/ ротки без аллергена, аллергена беэ сыворотки и сыворотки с неспецифическим аллергеном.

При анализе результатов за пороговое значение ХЛ-ответа мононуклеарных клеток, активиЗированных иммунным комплексом (специфическим аллергеном), принимают увеличение интенсивности свечения не менее, чем в 3 раза по сравнению с контролем сыворотки с неспецифическим аллергеном, и не менее, чем в 6 раз по сравнению со спонтанной хемилюминесценцией мононуклеарных клеток больного.

Хемилюминесценцию суспензии мононуклеарных клеток измеряют на люминометре 1.КВ-1251 или люминометре Свет".

Пример 1. Больной Д,, 22 лет.

Диагноз: бронхиальная астма, атопическая форма, 1-я стадия, нестойкая ремиссия, бытовая аллергия, обструктивная эмфизема легких.

В качестве аллергена использовали растворы пылевых аллергенов сер.153 и 175 в разведении 1:1000, конечная концентрация 10рИБ/мл. Интенсивность спонтанной хемилюминесценции 50 мкл суспензии мононуклеарных клеток больного составила 16,5-17,1 мВ, хемилюминесценция, индуцированная сывороткой больного с пылевым аллергеном сер. 153, равнялась 36,7 мВ, а с аллергеном сер. 175 повысилась до

134,3 мВ, т.е. в 3,7 раза, превышая уровень спонтанного ХЛ-ответа в

7,9 раз.

Заключение: специфический пылевой аллерген сер. 175, сенсибилизация низкая, Пример 2, Больной Г,, 16 лет.

Диагноз: бронхиальная астма, атопическая форма, 1-я стадия, обострение; бытовая аллергия.

Использовали растворы пылевых аллергенов сер, 112 и 127 в разведении

1:1000, конечная концентрация аллергена 7pNU/мл. Интенсивность спонтанной хемилюминесценции клеток больного 7,8-7,9 мВ, хемилюминесценция,индуцированная сывороткой больного с пылевым аллергеном сер. 112, равнялась 37,2 мВ с аллергеном сер.127 повысилась до 295,0 мВ, т.е. в 7,9 раз, превышая спонтанный ХЛ-ответ клеток в 37,3 раз.

Составитель М. Васильев

Техред В.Кадар

Редактор П. Гереши

Корректор И. Муска .

Заказ 4042/38 Тираж 776

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5

Подписное

Производственно-полиграфическое предприятие, r. Ужгород, ул. Проектная, 4 з 13358

Заключение: специфический аллерген домашней пыли сер. 127, сенсибилизация высокая.

Пример 3. Больной С °, 30лет, Диагноз: бронхиальная астма, атопическая форма, 1-я стадия, легкое течение, стадия нестойкой ремиссии, поллиноз

Использовали растворы пыльцевых аллергенов ржи и.травы ежа при разведении 1:1000 в концентрации 5pNU/мл.

Интенсивность спонтанной хемилюминесценции клеток больного 6,9-6,9 мВ, 15

Хемилюминесценция, индуцированная сывороткой больного с аллергеном ржи, 32,0 мВ, с аллергеном травы ежа

220,0 mV, т.е. вьппе, чем в случае с применением аллергена ржи, в 6,87 20 раз,и выше спонтанной в 31,9 раз.

78

Заключение: специфический аллерген травы ежа, сенсибилизация высокая.

Ф о р м у л а изобретения

Способ определения специфического аллергена при атопической бронхиальной астме путем добавления аллергена к мононуклеарным клеткам крови пациентов с последующим его выявлением, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа,выявление специфического аллергена ве-, дут с помощью люминолзависимой хемилюминесценции по интенсивности свечения до и после добавления сыворотки больного, при этом аллерген берут в концентрации 5-10 pNU/ìë при соотношении с сывороткой 1:5 и при увеличении свечения в 6 и более раз определяют наличие специфического аллергена.