Способ определения размера клеток

 

Для повышения точности определения клетки помещают в инкубационную среду, добавляют полиэтиленгликоль. Определяют показат.ель пре- ;1омления клеток и фотометрируют. 00 оо 00 4 СО

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН

gg 4 С 01 N 33/48

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

И А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3748690/28-14 (22) 01. 06. 84 (46) 15.09.87. Бюл. У 34 (71) Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов АН СССР и Саратовский государственный университет им.Н.Г.Чернышевского (72) Б.И.Шварцбург (53) 612.014.4 (088.8) (56) Еленин В.И. и др. Определение относительного показателя преломления, размеров и концентрации эритроцитов по спектру мутности. — Биофизика, 1978, т. 23, У 4, 658-663.

ÄÄSUÄÄ 1337349 А1 (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ РАЗМЕРА КЛЕ"

ТОК (57) Для повышения точности определения клетки помещают в инкубационную среду, добавляют полиэтиленгликоль. Определяют показатель пре,помпения клеток и фотометрируют.

1ЗЗ7З49

Изобретение относится к биологии и медицине и может быть использовано для определения размера животных и микробных клеток, морфологического показателя физиологического состояния клеток, Целью изобретения является повышение точности определения размеров различных видов микробных и животных

Клеток, Указанная цель достигается тем, что клетки помещают в инкубационную среду, вводят стабилизирующую добавку с последующим фотометрированием, в качестве добавки используют полиэтиленгликоль и дополнительно определяют показатель преломления клеток.

Способ осуществляется следующим образом. 20

Приготавливают инкубационную среду растворением необходимых минеральных солей для поддержания рН и изотоничности среды. В зависимости от вида клеток и условий эксперимента кон- 25 центрацию солей и рН среды могут варьировать. В инкубационную среду вносят навеску полиэтиленгликоля и перемешивают до полного растворения полимера. Концентрацию полиэтиленгликоля д0 увеличивают до тех пор, пока показатель преломления среды не достигнет значения 1,38-1,4. Из исходного концентрированного раствора приготавливают разведением серию растворов с показателем преломления 1,33-1,4 с градиентом показателя преломления примерно 0,01, Таким образом получают.ряд из 5-6 значений показателя р Р p д 4о показатель преломления инкуба-, ционной среды без добавок полиэтилен— гликоля. Показатели преломления сред измеряют на рефлектомегре, В пробирку дозируют постоянный объем среды с оп В ределенным значением показателя преломления. В каждую пробирку вносят одинаковые концентрации клеток и тщательно перемешивают до полного диспергирования клеток в среду, Суспензию переносят в кювету спектрофотометра и измеряют спектральную зависимость оптической плотности. Из спектральной зависимости оптической плотности определяют волновой экспонент и для каждого . По определенному

Ср и для р из графика или таблицы n= (9) "ах дят "ар тр у. и зависимости ф от показателя преломления среды р, экстраполяцией прямой до пересечения с осью абсцисс получают значение показателя преломления клетки,„. Найденные параметры р и р, подставляют в формулу и вычисляют размер клетки: г

4 Т(p,(m-1) где r — радиус клетки; — длина волны света

m — относительный показатель преломления, m = к 7Ф о

Пример 1. Определение размеров,црожжевых клеток Sci zosacharamyces cpecies.

Клетки выращивают на агаризованном сусле 48 ч, дважды отмывают физиологическим раствором, Готовят инкубационную среду. растворением полиэтиленгликоля (молекулярная масса

20 тыс.) в 0 15 М NaC1 забуференном ацетатным буфером до рН 4,8 (оптимальное значение рН жизнедеятельности клеток данного штампа). Показатель преломления данной среды составлял 1,384. Из исходного концентрированного раствора готовят разведением в забуференном 0,15 N NaC1 растворы с показателями преломления 1,353, 1,357,: 1,363, 1,373. Показатель преломления инкубационной среды .без полиэтиленгликоля р. 1,334. Измерения

0 показателей преломления сред проводят на рефлектометре ИРФ-23, В пробирки дозируют по 2 мл среды с определенным значением показателя преломления. В каждую пробирку вносят по

0,2 мл концентрированной суспензии и тщательно перемешивают, Полученные суспензии переносят в оптическую кювету длиной 1 см и измеряют на спектрофотометре СФ-28 зависимость оптической плотности от длины волны в дит апазоне длин волн 400-600 нм. По измеренным данным строят графики 1gD-

1gP из наклона полученных прямых определяют волновой экспонент и для каждого значения к . Для волноср вой экспонент составлял 0,98. Далее и из построения "3 — y экстраполяцией

Ср прямой до пересечения с осью абсцисс получают значение показателя преломления клетки ц,,=1,404, Определив вычисляют относительный показатель преломления клетки m=1,404/1,334=

Составитель Е. Колмакова

Техред И.Верес

Редактор М.Циткина

Корректор И.Муска

Тираж 775

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

1 1 3035, Москва, Ж-35, Раушская наб ., д. 4/5

Подписное

Производственно-полиграфическое предприятие, r.Óæãîðîä, ул.Проектная,4 з 13

=1,05, Из графика п=п(р) для m=1,05 находим параметр о. При n=0,98 иско" .мая величина р=2,95. Подставив найденные параметры р и m в формулу (1), получаем радиус клетки r=1,7 мкм.

Пример 2. Определение размеров микробных клеток.

В эксперименте использовали 24-часовую культуру, выращенную на жидкой минеральной среде. Клетки дважды отмывали физиологическим раствором, Готовили инкубационную среду растворением полиэтиленгликоля в трис-буфере рН 7,4. Дальнейшие действия по приготовлению ряда инкубационных сред с различным значением показателей преломления, приготовлению суспензии клеток, фотометрированию и т.д. ана логичны примеру 1.

В среде с,и =1,334 волновой экспонент был равен 2. Показатель преломления клеток g.coli y„=1,38, относительный показатель преломления ш=1,03, параметр р =0,7. Отсюда размер клеток 0,68 мкм.

Пример 3. Определение размеров эритроцитов человека.

Эритроциты трижды отмывали физиологическим раствором от белков плаз- .

37349

4 мы. Готовили инкубационную средурастворением полиэтиленгликоля в фосфатном буфере с рН 7,2. Дальнейшие действия аналогичны примерам 1 и 2 за исключением выбора спектрального диапазона. В связи с наличием полос поглощения при 1 (600 нм гемоглобином эритроцитов, измерения оптической плотности проводились в диапазоне 600-900 нм.

В среде с ц =1,334 n=0,3. Показатель преломления эритроцитов 1,42, 15 относительный показатель преломления

1,07, параметр р 3,7. Отсюда размеры эритроцитов 2,3 мкм .

Формула изобретения

Способ определения размера клеток путем помещения клеток в инкубационную среду, введения стабилизирующей добавки с последующим фотометрирова25 нием, отличающийся . тем, что, с целью повышения точности on1 ределения в качестве добавки испольФ зуют полиэтиленгликоль и дополни-тельно определяют показатель прелом:ления клеток.