Способ определения относительной активности дегидрогеназ в лейкоцитах крови
Изобретение относится к биохимии , предназначено для медицинской практики. Цель изобретения - повышение точности и ускорение способа путем сокращения числа приемов, последовательной инкубации мазка крови в средах с субстратами дегидрогеназ и регистрации оптической плотности инкубационного раствора. Для этого лейкоциты после центрифугирования в виде белой полоски на границе эритроциты - плазма наносят па стекло , втягивают в стандартньш капилляр , центрифугируют, определяя гематокрит. После центрифугирования из лейкоцитов готовят мазок, фиксир уют 30 с в 70%-ном растворе ацетона в ЗР мМ фосфатном буфере при рН 7,4, затем 30 с отмывают в таком же растворе без ацетона и без подсушивания помещают в среду, содержащую субстрат одного из исследуемых ферментов - сукцинатдегидрогеназы (СДГ), ot-глицерофосфатдегидрогеназы ( ГФДГ) или НАДН-дегидрогеназы. Все среды содержат 30 мМ неорганического фосфата рН 7,4. Первая среда (для определения активности d-ГФДГ) содержит 10 мМ глицерофосфата, 0,3 мМ малонатаи 1 мМ тетразолия п-нитротетразолий фиолетовый, вторая среда (для СДГ) содержит 1 мМ сукцината и 1 мМ пНТФ; третья (для дегидрогеназ, окисляющих НАДН) - 0,2 мМ п-НТФ, 1 мМ малоната и 1 мМ НАДН. Длительность инкубации мазка 2 мин соответствует достижению окраски, достаточной для ,фотометрирования. Определяют соотношение активности разных дегидрогеназ, полученных при фотометрировании образца с соответствующими субстратами, и сопоставляют с соотношением их активностей к норме . ю (Л 00 to о ел
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК
20751 А1 (191 (11) (5g 4 G 01 N 33/48
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР
ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ: д:
К АВТОРСКОЬ У СВИДЕТЕЛЬСТВУ gg<.:.,-д,";: р
> (21) 3927834/28-14 (22) 11. 07. 85 (46) 30.06. 87. Вюл. 9 24 (71) Институт биологической физики
АН СССР (72) Л. Х. Эйдус (53) 616. 07 (088. 8) (56) Нарциссов Р. П. Архив анатомии эмбриологии, гистологии, 1969, т. 5, с. 85-91. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОТНОСИТЕЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ДЕГИДРОГЕНАЗ В ЛЕЙКОЦИТАХ КРОВИ (57) Изобретение относится к биохимии, предназначено для медицинской практики. Цель изобретения — повышение точности и ускорение способа путем сокращения числа приемов, последовательной инкубации мазка крови в средах с субстратами дегидрогеназ и регистрации оптической плотности инкубационного раствора. Для этого лейкоциты после центрифугирования в виде белой полоски на границе эритроциты — плазма наносят на стекло, втягивают в стандартный капилляр, центрифугируют, определяя гематокрит. После центрифугирования из лейкоцитов готовят мазок, фиксируют
30 с в 707-ном растворе ацетона в ЗР мМ фосфатном буфере при рН 7,4, затем 30 с отмывают в таком же растворе без ацетона и без подсушивания помещают в среду, содержащую субстрат одного из исследуемых ферментов — сукцинатдегидрогеназы (СДГ), Ы-глицерофосфатдегидрогеназы (ЫГФДГ) или НАДН-дегидрогеназы. Все среды содержат 30 мМ неорганического фосфата рН 7,4. Первая среда (для определения активности 3 -ГФДГ) содержит 10 мМ глицерофосфата, 0,3 мМ малоната и 1мМ .тетразолия и †нитротетразолий фиолетовый, вторая среда (для СДГ) содержит 1 мМ сукцината и
1 мМ пНТФ; третья (для дегидрогеназ, окисляющих НАДН) — 0,2 мМ п-НТФ, 1 мМ малоната и 1 мМ НАДН. Длительность инкубации мазка 2 мин соответствует достижению окраски, достаточной для,фотометрирования. Определяют соотношение знайений активности разных дегидрогеназ, полученных при фотометрировании образца с соответствующими субстратами, и сопоставляют с соотношением их активностей к норме.
ВНИИПИ Заказ 2655/49 Тираж 776 Подписное
Произв.-полигр. пр-тие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4
1 132075
Изобретение относится к биохимии и может найти применение в медицинской практике.
Цель изобретения — повышение точности и ускорение способа за счет сокращения числа приемов и последовательной инкубации мазка крови в средах, содержащих субстраты дегидрогеназ, регистрации оптической плотности инкубационного раствора. f0
Способ осуществляют следующим образом.
Мазок готовили из лейкоцитов крови, взятой от доноров для определения в ней фибриногена по стандартной 15 методике, принятой в клинических лабораториях (в 10 мл коническую пробирку, содержащую 0,5 мл 1,35Х-ного цитрата натрия, вводили, помешивая, 5 мл венозной крови и центрифугирова- 20 ли 5-7 мин при 1500 об/мин на центрифуге с радиусом ротора 10 см). 100 микролитров лейкоцитов, находившихся в пробирке после центрифугирования в виде белой полоски на границе эритроциты — плазма, наносили на стекло и, пользуясь капиллярными силами, втягивали их в стандартный
7,5 см капилляр для определения гематокрита, заклеивали его с одного З0 конца замазкой и центрифугировали в режиме определения гематокрита, После центрифугирова ия из лейкоцитов, находившихся в капилляре в виде белой полоски длиной 0,5-1 см, З5 готовили мазок на предметном стекле размером кюветы имеющегося ФЭКа, После подсушивания на воздухе при комнатной температуре мазок фиксировали в течение 30 с в 707.-ном раство- 40 ре ацетона в 3Р мИ фосфатном буфере при рН 7,4, затем 30 с отмывали в таком же растворе без ацетона и без подсушивания помещали в среду, содержащую субстрат одного из исследуемых 45 ферментов — сукцинатдегидрогеназы (СДГ), d -ãïèöåðîôîñôàòäåãiùðîãåíàçû (с -ГФДГ) или НАДН-дегидрогеназы.
Все среды содержали 30 мИ неорганического фосфата (любой степени . 50 замещенности) при рН 7,4. Первая среда (для определения активности митохондриальной 4-ГФДГ) включала 10мИ
1 2 глицерофосфата, 0,3 мМ малоната и
1 мМ тетразолия п-нитротетразолий фиолетовый (п-НТФ, Кеапл1 Венгрия), вторая среда (для СДГ) содержала
1 мМ сукцината и 1 мМ пНТФ, третья (для дегидрогеназ, окисляющих НАДН)—
0,2 мИ п-НТФ, 1 мМ малоната и 1 мМ
НАДН.
Длительность инкубации мазка в кювете ФЭКа с каждой средой 2 мин соответствует достижению окраски, достаточной для фотометрирования на приборе ФЭК. Больший интервал лишь удлиняет процедуру.
Далее определяют соотношение значений активностей разных дегндрогеназ, полученных при фотометрировании образца с соответствующими субстратами, и сопоставляют с соотношением их активностей в норме.
Исследовано распределение соотношений активности 3-х ферментов у
32 здоровых доноров, характеризующих норму. Отношение активности СДГ/А.
ГФДГ у всех доноров находилось в интервале 85-115 при среднем значении 100, для отношения НАДН/d-ГФДГ— в интервале 85-115Х при среднем значении 100, для отношения НАДН/4-ГФДГ - в интервале 180-240 при среднем 210, т. е. в норме отношение активностей для этих ферментов в лейкоцитах человека характеризуется отклонением от среднего значения на 5-107.
Формула и з о б р е т е н и я
Способ определения относительной активности дегидрогенаэ в лейкоцитах крови, включающий инкубацию мазка в среде, содержащей субстрат и соль тетразолия с последующим фотометрическим измерением, о т л и— ч а ю шийся тем, что, с целью повышения точности и ускорения способа, мазок последовательно инкубируют в средах, содержащих субстраты дегидрогеназ, каждый раз регистрируют оптическую плотность инкубационного раствора и по соотношению полученных значений определяют относительную активность ферментов.
