Способ определения электронно-донорной активности химических соединений

 

Изобретение относится к биофизике и биохимии. Цель изобретения - повьшение чувствительности способа. В контрольный и опытный образцы вводят гемсодержащее соединение, освещают непрерывным светом и измеряют начальную скорость изменения оптической плотности в полосе поглощения гемсодержащего соединения. Электроннодонорную активность тестируемого соединения определяют по увеличению скорости изменения оптической плотности в опытном образце по сравнению с контрольным. Выбор в качестве тестсоединения гемсодержащих соединений определяется высоким значением их коэффициента экстинкции, а также удовлетворительным разнесением полос поглощения восстановленной и окисленной форм этих соединений. 2 з.п. ф-лы, § 1 табл. (Л со ю о со

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

А1 (511 4 G 01 N 33/48

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

H ABTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

БКБЛНч г YА

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 3976000/28-14 (22) 10.11.85 (46) 30.06.87. Бюл. и 24 (71) Институт биологической физики

АН СССР (72) Б.С. Маринов (53) 612.015(088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

Р -1143193, кл. С 01 N 33/48, 1984. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЭЛЕКТРОННОДОНОРНОЙ АКТИВНОСТИ ХИМИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИй (57) Изобретение относится к биофизике и биохимии. Цель изобретения повышение чувствительности способа.

В контрольный и опытный образцы вводят

;„,SU„„1320749 гемсодержащее соединение, освещают непрерывным светом и измеряют начальную скорость изменения оптической плотности в полосе поглощения гемсодержащего соединения. Электроннодонорную активность тестируемого соединения определяют по увеличению скорости изменения оптической плотности в опытном образце по сравнению с контрольным. Выбор в качестве тестсоединения гемсодержащих соединений определяется высоким значением их коэффициента экстинкции, а также удовлетворительным разнесением полос поглощения восстановленной и окисленной форм этих соединений. 2 з.п. ф-лы

1 табл.

1320749 2

Изобретение. относится к биохимии .и биофизике и может быть использова»о в фармакологии для первичной оцен- ки биологической активности химических соединений на стадии предбиологических испытаний. . Целью изобретения является повышение чувствительности способа за счет введения в образцы гемсодержащего соединения.

Способ осуществляют следующим образом.

В контрольный и опытные образцы вводят гемсодержащее соединение, которое, являлясь акцептором электронов,изменяющий свой цвет при восстановле»ии, служит удобным тест-соединением для определения электроннодонорной активности химических соединений. Затем опытный и контрольный образцы освещают непрерывным светом и измеряют начальную скорость изменения оптической плотности в полосе поглощения гемсодержащего соединения, Электронно -донорную активность тес,тируемого соединения определяют по увеличению скорости изменения оптической плотности в опытном образце по сравнению с контрольным.

При этом для определения электрон»о-донорной активности водорастворяемых соединений в качестве гемсодержащего соединенйя используют гемсодержащий блок, а для водонерастворимых соединений — гемин °

Выбор в качестве тест-соединения именно гемсодержащих соединений определяется высоким значением их коэффициента экстинкции, составляюшим

1-1,5 10 M см ", а также удовлетворительным (около 20 нм) разнесением полос поглощения восстановленной и окисленной формы этих соединений, что в совокупности и обеспечивает высокую чувствителъность предлагаемого способа.

Пример 1. Определение электронно-донорной активности блокаторов кальциевых каналов у риосидила, верпамила, дилтиазема (все соедине»ия водорастворимы) по восстановле»ию миоглобина.

Опытный образец, представляющий собой водный раствор объемом 2 мл, содержащий 1 ° 10 М красителя эозина, 1 10 И миоглобина и 1-10 И ри-5 осидила, поместили в герметизирован»ую оптическую кювету и удалили со5

f0

f5

40 держащийся в растворе кислород путем осторожной откачки на форвакуумном

& насосе (до 10 торр) в течение 30 мин.

Деаэрированный образец поместили в термостатированное кюветное отделение спектрофотометра СФ-10 (можно также использовать СФ-14 или "Спекорд") и записали исходный спектр поглощения опытного образца. Затем этот образец освещали светом лампы накаливания (100 Вт), пропущенным через светофильтр ЖС-18 (М 500 нм), и записывали спектр поглощения образца через 1,2,3,4,5 и 6 мин освещения.

Освещение опытного образца приводит к изменению спектра поглощения акцептора электронов-миоглобина. При этом исходная полоса поглощения окисленного миоглобина уменьшается и возрастает более длинноволновая полоса, соответствующая восстановленной форме миоглобина.

По приращению поглощения длинноволновой полосы за время освещения опытного образца в течение 1,2 3 и

4 мин строили кинетическую кривую фотовосстановления миоглобина в присутствии риосидила.

Такие же операции проводили и с контрольным образцом, не содержащим риосидила и строили кинетическую кривую восстановления миоглобина в контрольном образце.

Аналогично тестировали верапамил (содержание его в опытном образце

1 10 М) и дилтиазем (содержание в опытном образце 1 .10 4 М) и строили кривые восстановления миоглобина в их отсутствии, За 1-ю мин освещения контрольного и опытного (с риосидилом) образцов миоглобин в присутствии риосидила восстанавливается почти в 6 раз (5,7) быстрее, чем в контроле (так, за

2 мин освещения в опытном образце восстанавливалось 407 содержащегося в образце акцептора миоглобина, за то же время в контрольном образце восстановилось всего 77 миоглобина).

Восстановление миоглобина за 1 ю мин освещения опытных образцов двумя другими блокаторами кальциевых каналов — верапамилом и дилтиаземом— происходит с одинаковой скоростью, которая примерно в 3 раза меньше, чем в образце с риосидилом.

Таким образом, наибольший электронно-донорной активностью обладает

Время освещения образца, мин

12

Увеличение поглощения на 416 нм

О, 125 0,275 0,40 0,44 0,45

Доля восстановленного цитохрома С

0,25

3 132074 риосидил,а верапамил и дилтиазем обладают одинаковой электронно-донорной активностью.

Определенное предлагаемым способом различие в электронно-донорной активности блокаторов кальциевых каналов, а именно, риосидил верапамил = дилтиазем, коррелирует с их биологической активностью, наблюдаемой в электрофизиологических ис- 10 следованиях.

Для сравнения чувствительности предлагаемого способа и способа по прототипу построены кинетические кривые уменьшения поглощения анион-ради- 15 калов красителя иозина при импульсном освещении контрольного образца и опытных образцов, содержащих

1 10 4 M риосидила и 25 10 И риосидила, Начальная скорость исчезновения 20 радикалов красителя равна 5 в произвольных единицах (отношение уменьшения концентрации анионов красителя ко времени освещения образца). В опыт. ном образце, содержащем 1 ° 10 М бло- 25 катора каналов риосидила, начальная скорость изчезновения радикалов замедлилась до 2, 7 в тех же единицах, Таким образом, отличие в величине измеряемого эффекта, вызываемого одинако- 30 вой концентрацией тестируемого вещества, в контрольном и опытном образцах составляет по способу-прототипу

5:2,7=1,8 раза по сравнению с 0,40:

Начальная (за первые 2 мин осве-" щения) скорость фотовосстановления цитохрома С в присутствии фелодипина составила 197., в то время как при тех же условиях освещения фотовосстановление цитохрома С в контрольном образце за первые 2 мин освещения составило всего 27. Таким образом, фелодипин ускоряет фотовосстановление акцептора жлектронов цитохрома

С примерно в 10 раз, что свидетельствует о его высокой электронно-доО 07-5 7 раза по преплагае аму способу.

Следовательно, предлагаемый способ чувствительнее известного в 3 раза (5,7 .1;8=3) °

Пример 2. Определение электронно-донорной активности блокатора кальциевых каналов — фелодипина (водорастворимое соединение) по восстановлению цитохрома С., Опытньпi образец объемом 2 мл, содержащий водный раствор красителя эозина (1 10 М) цитохрома С (1 10 М) и фелодипина (1.10 К), поместили в оптическую кювету и дэаэрировали как описано в примере 1. Таким же образом готовили контрольный образец, не содержащий фелодипина.

Контрольный и опытный образцы исследовали на обычном спектрофотометре Сф-10 так же, как описано в примере 1, и записывали спектр поглощения образцов через каждые 3 мин освещения их непрерывным светом.

При освещении образцов происходит фотовосстановление цитохрома с увеличением полосы поглощения с макси мумом на 416 нм (максимум поглощения окисленного цитохрома С вЂ” 410 нм).

В таблице представлена кинетика фотовосстановления акцептора электронов цитохрома С блокатором кальциевых каналов фелодипином, в контрольном и опытном образцах.

0,55 0,80 0,88 0,90 норной активности. Кроме того, гемсодержащий белок — цитохром С может быть успешно использован в качестве акцептора электронов, изменяющего свой спектр поглощения при восстановлении, для определения электронно-донорной активности химических соединений.

Пример 3. Определение электронно-донорной активности водонерастворимых соединений аймалина и

Формула изобретения

Составитель Н. Гуляева

Техред М.Ходанич

Редактор Е. Копча

Корректор В. Бутяга

Заказ 2655/49 Тираж ?76 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

5 132 бензокаина (блокатры натриевых каналов) С по восстановлению гемина.

Опытный образец объемом 2 мл, содержащий в качестве растворителя смесь диметилсульфоксида и воды в отношении 4: 1, а также краситель эритрозин (иодзамещенный аналог красителя эозина) (1,5- 10 M) акцептор электронов гемин -1,5 .10 М и тестиГ руемое соединение аймалин -1 10 M помещали в герметическую оптическую кювету и подвергали процедурам, описанным в примере 1.

Освещение опытного образца приводит к изменению спектра поглощения акцептора электронов — гемина.

При этом исходная полоса поглощения окисленного гемина уменьшается и возрастает более длинноволновая полоса, соответствующая восстановленной форме гемина.

По приращению поглощения длинноволновой полосы за время (в течение

5, 10, 15 мин) освещения опытного образца строили кинетическую кривую фотовосстановления гемина в присутствии аймалина.

Такие же операции проводили и с контрольным образцом, не содержащим аймалин, и строили кинетическую кривую восстановления гемина.

Из сравнения кривых видно, что аймалин является эффективным донором электронов (восстановление гемина в присутствии аймалина за первые 2 мин освещения образцов почти в 12 раз быстрее, чем в контрольном образце), что хорошо согласуется с биологической активностью аймалина-антиаритмика

Аналогично тестировали бензокаин (1 10-> M) — блокатор натриевых каналов и строили кривую фотовосстановления гемина в его присутствии.

Бензокаин обладает хотя и слабой электронно-донорной активностью (вос0749 6 становление гемина в присутствии бензокаина только в 2 раза быстрее, чем в контроле, за первые 2 мин освещения образцов), но достаточно хорошо детек5 тируемой предлагаемым способом.

При исследовании бензокаина способом-прототипом его электронно-донорные свойства не обнаруживаются, что также свидетельствует о более высокой чувствительности предлагаемого способа, 1. Способ определения электроннодонорной активности химических соединений путем регистрации взаимодействия тестируемых соединений в растворе с красителем, включающий осве2п щение образца в полосе поглощения красителя с последующим спектрофотометрированием, отличающийся тем, Э что с целью повышения чувствительности способа, в контрольный и

2 опытный образцы дополнительно вво.— дят гемсодержащее соединение, образцы освещают непрерывным светом и измеряют начальную скорость изменения оптической плотности в полосе погло30 щения гемсодержащего соединения и по увеличению скорости изменения оптической плотности определяют электронно-донорнуЮ активность.

2. Способ по п. 1, о т л и ч а ю35 шийся тем, что, с целью определения электронно-донорной активности водорастворимых соединений, в качестве гемсодержащего соединения используют гемсодержащий белок.

40 . 3, Способ по п. 1, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью определения электронно-донорной активности водонерастворимых соединений, в качестве гемсодержащего соединения ис45 пользуют гемин.