Способ определения активности трипсина

 

Изобретение относится к биохимии . Цель изобретения - ускорение и повышение чувствительности способа. Фотопластинки засвечивают, проявляют , фиксируют и обрабатывают раствором дансилхлорида в смеси ацетона с бикарбонатным буфером Промывают в ацетоне, спирте, воде и высушивают. Исследуемый препарат наносят на фиксированную и высушенную поверхность желатинового слоя фотопластинки, инкубируют . Пластинки промывают и просматривают в ультрафиолете, регистрируя зоны лизиса. В ряд проб с различным разведением трипсина добавляют известное количество ингибитора трипсина , инкубируют смесь и наносят на пластинки Количество трипсина определяют по степени проявления зон лизированного желатинао Максимальная чувствительность пластинок к трипсину составляет 0,1 нг в 1 мкл. 1 з.п.ф-лы. с (Л оо I4D О ю ю NU

СОаз СОВЕТСКИХ соцИАлистичесних

РЕСПУБЛИК (дц 4 С 12 1/38 G. 01 N 33/48

К A BTGPCHGMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОбРЕТЕНИЙ И ОТКРЬГГИЙ (21) 3906630/28-14 (22) 23.04.85 (462 30.06.87. Бюл. Х 24 (71) Институт экспериментальной биологии АН АрмССР (72) А.А. Арутюнян, А.Х. Ханазадян, А.М. Арзуманян и Т.Н. Акопян (53) 612.015 (088.8) (56) Рябушко Т.А., Вечер А.С. Прикладная биохимия и микробиология, 1965, т. 1, в, 6, с. 645, (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ

ТРИПСИНА (57) Изобретение относится к биохимии. Цель изобретения — ускорение и повышение чувствительности способа, Фотонластинки засвечивают, проявля„„SU„„1320224 А1 ют, фиксируют и обрабатывают раствором дансилхлорида в смеси ацетона с бикарбонатным буфером. Промывают в. ацетоне, спирте, воде и высушивают.

Исследуемый препарат наносят на фиксированную и высушенную поверхность желатинового слоя фотопластинки, инкубируют. Пластинки промывают и просматривают в ультрафиолете, регистрируя зоны лизиса. В ряд проб с различным разведением трипсина добавляют известное количество ингибитора трипсина,инкубируют смесь и наносят напластинки. Количество трипсина определяют по степени проявления зон лизированного желатина. Максимальная чувствительность пластинок к трипсину составляет 0,1 нг в 1 мкл. 1 з.п.ф-лы.

1320224 г

Изобретение относится к биохимии, а именно к способам определения активности трипсина и его ингибитора, и может быть использован в медицине для определения трипсина в диагности- 5 ческих целях.

Цель изобретения — ускорение и повышение чувствительности способа за счет использования в качестве субстрата поверхностно-модифицированного флюоресцирующим реагентом — дансилхлоридом (диметиламинонафталинсульфонилхлоридом) ультратонкого слоя желатина.

Способ осуществляется следующим образом.

Фотопластинки засвечивают, проявляют, фиксируют и обрабатывают раствором дансилхлорида в смеси ацетон— бикарбонатный буфер 9:1, последовательно промывают в ацетоне, спирте, воде и высушивают.

Исследуемый препарат наносят на фиксированную и высушенную поверхность желатинового слоя фотопластин25 ки, затем инкубируют во влажной камере. После инкубации пластинки тщательно промывают и просматривают в ультрафиолете, регистрируя зоны лизиса в виде темных пятен на фоне желтозеленой флюоресценции.

Для количественного определения трипсина в ряд проб с различным разведением трипсина добавляют известное количество ингибитора трипсина, 35 инкубируют смесь и наносят на пластинки. Затем проводят инкубацию во влажной камере и определяют количество трипсина по степени проявления зон лизированного желатина. 40

П р.и м е р 1. Обработка фотопластинок.

Фотографические пластинки (микрат

СК размером 9 12 см или пластинки для ядерных исследований размером 45

6 9 см) засвечивают, проявляют на свету, фиксируют, тщательно промывают водой, промывают в течение 60 мин в этиловом спирте с трехкратной сменой спирта, промывают 60 мин в ацето-50 не с трехкратной его сменой. Полностью высушенную пластинку помещают на 5 ч в 0,5Х-ный раствор дансилхлорида в смеси ацетон — О,IM NaHC0 (9:1), затем промывают в течение 55

30 мин в ацетоне с трехкратной сменой,. 30 мин в спирте с трехкратной сменой и в течение 1 ч в воде с шестикратной сменой, затеи высушивают на воздухе„ Полученные таким способом готовые к употреблению пластинки упаковывают змульсионными слоями, друг к другу и хранят (срок хранения приготовленных таким образом пластинок сос гавляет не менее шести месяцев).

Для получения пластинок с обозначенными полями фотопластинку экспонируют под сеткой с обозначенными светлыми полями размером 5 5 мм и черными линиями толщиной 0,5 мм. Далее фотопластинку проявляют, фиксируют и модифицируют дансилхлоридом, как описано вьппе. Подготовленные таким образом пластинки с 320 полями многократно используются для анализов до исчерпания свободных полей.

Определение чувствительности пластинок к разным протеолитическим активностям.

Пробы ферментов трипсина, химотрипсина, папаина (каждая объемом в

10 мкл) в 0,1М фосфатном буфере, рН

7,6, и пепсина в О, 1М СН СООН, содержащие О,1; 1,0; 1О; 100 нг/мкл фермента, наносят в виде капли на поверхность подготовленных пластинок и выдерживают во влажной камере 60 мин о„ при 20 С, промывают в течение 1 мин водой, помещают в спиртовой раствор, на 1 мин, затем высушивают 1 мин и визуалиэируют под ультрафиолетовой лампой. На фоне интенсивной желтозеленой флуоресценции обнаруживают; черные точки лизиса. Полный лизис всей толщи желатина, включая основной немодифицированный дансилхлоридом слой желатина, наблюдается в точке

100 нг/мкл трипсина. Разная степень лизиса только модифицированного слоя желатина наблюдается в точках 0,110 нг/мкл тричсина; в случае других ферментов лизис наблюдается в точках

10-100 нг/мкл. Эти данные свидетельст- вуют о том, что подготовленный описанным вьппе способом слой желатина избирателен и специфичен к трипсину, но не к другим апробированным ферментам. При этом максимальная чувствительность пластинок к трипсину составляет 0,1 нг/мкл.

Пример 2. Количественное определение активности трипсина и контрикала.

В примере представлены данные по титрованию ингибитора трипсина—

3 13202 контрикала (СОИТКТСА1., VEB ARZNEIMITТЕЫ4ЕКК, РКЕЗРЕЯ) трипсином (трипсин кристаллический СПОФА, ЧССР) с активностью, равной 7500 ЕД/мг БАЭЭ, .и раздельно трипсином фирмы КОСН-LIGHT 5

LAB,LTO (Англия, трипсин панкреатический, З-кратнокристаллизированный).

В 20 полиэтиленовых ампул (типа

Эпендорф) разливают по 100 мкл .0,1 М йа-фосфатного буфера, рН 7,6, содержащего 5 нг/мкл контрикала. В первые

10 ампул добавляют возрастающие количества (от 10 до 100 мкл) трипсина (СПОФА) в воде в концентрации 10 нг/мкл.

В той же последовательности в ампулы 15 добавляют воду (от 100 до 10 мкл) для получения одинакового объема (210мкл).

С остальными 10 ампулами повторяют описанную операцию с той разницей, что используется трипсин фирмы KOCH- 20

LIGHT. Смесь перемешивают, оставляют при 4 С 60 мин, затем по. 10 мкл наносят на пластинку (остальную часть проб хранят при 4 С), выдерживают во влажной камере 330 мин, промывают во- 25 дой 1 мин1 затем спиртом 1 мин, высушивают на воздухе и визуализируют под

УФ-излучением. При этом обнаруживается, что в опыте с трипсином СПОФА в пробах 1-7. активность подавлена, а 30 . в пробах 8-10 есть лизис. С трипси.ном фирмы KOCH-LIGHT активность выражена в пробах .6-10. На этом этапе уже можно грубо оценить как ингибирующую активность контрикала, так и 35 трипсина фирмы KOCH- IGHT. Проведенные расчеты показывают, что активность контрикала находится в пределах 5250-6000 антитрипсиновых ЕД/мг

БАЭЭ. Активность трипсина (KOCH-LIGHT), 40 равна 8800-12000 ЕД/мг БАЭЭ. При необходимости повышения точности анализа в зоне титрований 7-8 и 5-6 повторяют опыт. Оставшиеся части пробы 7 (трипсин СПОФА) и пробы 5 (трипсин 45

KOCH LIGHT) делят на 10 частей по

20 мкл, добавляют возрастающие объемы растворов трипсинов (от 1 до 10 мкл, концентрация .1 нг/мкл,. трипсин СПОФАв аликвоты пробы 7, трипсин фирмы

KOCH LIGHT - в аликвоты пробы 5) и воды (от 9 до 0 мкл), оставляют при

4 С на 60 мин. По 10 мкл из каждой пробы наносят на пластинку и дальше поступают, как описано выше.В резуль- 55 тате обнаруживается, что лиэис имеется в точках 7.3-7.10 и 5.6-5. 10.

На основе этих данных можно провести

24 4 более точный расчет активностей контрикала и трипсина фирмы KOCH LIGHT (соответственно 5400-5475 антитрипсиновых ЕД/мг БАЭЗ и 9750-9970 ЕД/Mr

БАЭЭ).

Пример 3. Измерение трипсинингибиторного баланса в крови.

100 мкл свежеполученной плазмы крови кролика разбавляют в 10 раз в

0,2 М натрийфосфатном буфере, рН 7,6, разливают в 10 полиэтиленовых ампул по 100 мкл. В каждую пробу добавляют возрастающие количества (от 1 до

10 мкл) раствора трипсина в воде (10 нг/мкл) и воду от 9 до 0 мкл, и инкубируют при 4 С 30 мин. Далее по

10 мкл из каждой пробы наносят на пластинку (остальную часть проб хранят при 4 С). Пластинку выдерживают

30 мин во влажной камере, промывают водой 1 мин, спиртом 1 мин, высушивают на воздухе и визуализируют под ультрафиолетом. Обнаруживается, что в пробах 1-6 активность трипсина подавлена, а в пробах 7-10 трипсин проявляет активность. С учетом этих .. данных проводят оценку протеинаэноингибиторного равновесия. При необходимости повышения точности анализа в зоне титрования 6-7 повторяют опыт. Оставшуюся часть проб .6 делят на 10 частей по 10 мкл каждая, добавляют по 1 мкл 1 М фосфатного буфера рН 7,6, затем в пробы добавляют возрастающие количества (от 1 до 10мкл) раствора трипсина (1 нг/мкл) и от 9 до 0 мкл воды, инкубируют 30 мин при

4 С, по 10 мкл от каждой пробы наносят на пластинку, выдерживают 30 мин, промывают водой, спиртом, сушат и визуализируют под ультрафиолетом.

Формула изобретения

1.Способ определения активности трипсина путем нанесения пробы на . фиксированную и высушенную поверхность желатинового слоя фотопластины, инкубации во влажной камере, промывания водой с последующим визуальным определением наличия активности по участкам лизированного желатина, отличающийся тем, что, с целью ускорения и повышения чувствительности способа, фотопластину предварительно засвечивают, перед фиксацией фотопластину проявляют, затем обрабатывают раствором дансилСоставитель Н. Гуляева

Техред И.Попович

Редактор И. Рыбченко

Корректор Л, Пилипенко

Заказ 2612/22 Тираж 499

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Подписное

Производственно-полиграфическое лредприятие, r. Ужгород, ул. Проектная, 4

5 1320224 6 хлорида в смеси ацетон — бикарбонат- чественного определения трипсина, в ный буфер 9:1, последовательно промы- ряд проб с различным разведением веют в ацетоне, спирте, воде и высу- трипсина добавляют известное колишивают, а наличие участков лизирован- чество ингибитора трипсина, смесь ного желатина определяют в ультра- 5 инкубируют наносят на пласфиолете в виде темных пятен на фоне тинки, а количество трипсижелто-зеленой флюоресценции. на определяют по степени

2, Способ по п. 1 о т л и ч а — проявления зон лизированного ю шийся тем, что, с целью коли- желатина.