Способ получения 2,5-дикето- @ -глюконовой кислоты

 

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 2,5-ДИКЕТО-1)-ГЛЮКОНОВОЙ КИСЛОТЫ путем культивирования ее продуцентов на питательной среде, содержащей П-глюкозу в качестве источника углерода , источники азота, фосфора, минеральные соли и стимулятор роста, в условиях аэрации среды с последующим выделением целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью упрощения и ускорения процесса ферментации при высоком выходе целевого продукта, в качестве продуцентов используют штамм Erwinia citreus АТСС 31623 или штаммы Erwinia punctata АТСС 31624, или Erwinia punctata АТСС 31625, или Erwinia punctata АТСС 31626, или Erwinia punetata АТСС 31627, или штаммы Erwinia terreus АТСС 31628, или Erwinia terreus АТСС 31629, или Erwinia terreus АТСС 31630,или Erwinia terreus АТСС 31631. 2. Способ по п. 1, о т л и ч щ и и с я тем, что концентрацию0-глюкозы в среде устанавливают от 5 до 20 об.%.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (I9) ((I)

SU, ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ . К ПАТЕНТУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3362894/28-13 (22) 13. 08. 81 (31) 112406/ 1980 (32) 14.08.80 .(33) JP (46) 07.11.85. Бюл. 9 41 (71) Сионоги энд Ко., Лтд (3P) (72) Такаясу Сонояма, Сигео Яги, Бундзи Кагеяма и Масахиро Танимото (л) (53) . 577. 1 5 (088. 8) (56) 1. Патент США ? 3998697, кл. С 12 P 7/58, опублик. 1978.

2. Заявка Японии У 51-33631, кл. С 12 D 1/02, опублик ° 1976. (54)(57) 1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ

2,5-ДИКЕТО-О-ГЛИКОНОВОЙ КИСЛОТЫ путем культивирования ее продуцентов на питательной среде, содержащей )-глюкозу в качестве источника углерода, источники азота, фосфора, ми(5))ЕС 12 P 7/58//С 12 P 7/58.

С 12 К 1:18. неральные соли и стимулятор роста, в условиях аэрации среды с последующим выделением целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью упрощения и ускорения процесса ферментации при высоком выходе целевого продукта, в качестве продуцентов используют штамм Erwinia (itreus ATCC 31623 uav mavmr Erwi"

nia punctata АТСС 31624, или Erwinia

punctata АТСС 31625, или Erwinia

punctata АТСС 31626, или Егч1п1а

pun@tata АТСС 31627, или штаммы

Erw1niа terreus АТСС 31628, или

Erwinia terreus АТСС 31629, или

Erwinia terreus АТСС 31630,или

Erwinia terreus АТСС 31631.

2. Способ по п. 1, о т л и ч a о шийся тем, что концентрацию.

D-глюкозы в среде устанавливают от 5 до 20 об.X.

1190992

Изобретение относится к техничес кой микробиологии, а именно к способу получения 2,5-дикето-3-глюконовой кислоты (2,5-ДКГ) с использованием микроорганизмов продуцентов, отно- S сящихся к новым штаммам микроорганизмов рода Erwinia.

Известен способ получения 2,5-дикето-1)-глютеновой кислоты путем культивирования аэробных микроорга- 10 низмов рода Pseudomonas fluorescens на питательной среде, содержащей

3-глюкозу в качестве источника углерода, источники азота, фосфора, минеральные соли, стимуляторы рос-: 15 та (1) .

Известен также способ получения

2,5-ДКГ, согласно которому в качестве лродуцента целевого продукта используют микроорганизмы рода 20

Acetobacter, которые культивируют в условиях аэрации среды на питательной среде, содержащей 3)-глюкозу в качестве источника углерода, источник азота, Фосфора, минеральные соли 25 и стимулятор роста в условиях аэрации среды с последующим выделением целевого продукта (2J .

Согласно этому способу в питательную среду дополнительно вводят З0 -пролин, что способствует увеличению выхода целевого продукта. Однако эта добавка хоть и увеличивает выход продукта, но не ускоряет процесс и к тому же его усложняет. Последний длится до 64 ч, что естественно приводит к большим расходам .энергии.

Целью изобретения является упрощение и ускорение процесса фермента- ции при высоком выходе целевого про- щ дукта.

Цель достигается тем; что согласно способу получения 2,5-дикето-Пглюконовой кислоты путем культивирования ее продуцентов на питательной среде, содержащей 2-глюкозу в качестве источника углерода, источники азота, фосфора, минеральные соли и стимулятор роста, в условиях аэрации среды с последующим выделением из SO

,культуральной среды целевого продукта, в качестве продуцентов используют штамм Егч1тпа с1 гепз АТСС

31623 или штаммы Erwinia punctata

АТСС 31624, или Erwinia punctata 55

АТСС 31625, или Erwinia punctata

АТСС 31626, или Erwinia punctata

АТСС 31627, или штаммы Еrwinia terreus АТСС 31628, или Erwinià terreus

АТСС 31629, или Frwinia terre. s

АТСС 81630, или Erwinia terreus

АТСС 31631.

Согласно предлагаемому способу концентрацию 0-глюкозы в среде следует устанавливать от 5 до 20 об.7.

Таким образом, предлагаемый способ можно осуществлять с использованием указанных штаммов рода Frvinia„ способных селективно окислять Л вЂ глюкозу и превращать ее в 2,5-ДКГ.

Эти штаммы перечислены в табл.

Они хранятся в институте исследования ферментации в Японии и в Американской коллекции культур в Вашингтоне.

Данные таксономических исследований этих микроорганизмов представлены в табл, 2.

A . Наблюдения.

1. Форма клеток (скошенный бульонный агар при 28 С в течение 24, 72 о и 168 ч).

Численно преобладают одиночные клетки, палочки укаэанных в таблице размеров с закругленными концами у всех штаммов. Иногда в некоторых штаммах наблюдаются деформированные клетки указанных размеров.

2, Подвижность и жгутикование (скошенный бульонный агар при 20 и

25 С в течение 18-24 ч).

Подвижность определяют методом висящей капли.

Жгутикование подтверждается под оптическим микроскопом после окрашивания по методике Тода или при помощи просвечивающего электронного микроскопа после культивирования по методике культивирования в поддерживаемой мембране °

Штаммы SHS-2003, 2004, 2005, 2006 и 2007 подвижные.

Штамм SHS-2008 подвижный с монолатеральным жгутиком.

Штаммы SHS-2009, 2010 и 2011 подвижные с одним или двумя латеральными жгутиками.

3. Споры не образуют ни один из приведенных штаммов.

4. Окрашивание по Граму (:кошенный бульонный агар лри 28 С в течение 24, 72, 168 ч). Отрицательная у всех из приведенных в таблице штаммов.

1190

5. Кислотостойкость. У всех штаммов отрицательная, Ь . Рост на различных средах (табл. 3).

1. Колонии на бульонном агаре при о

28 С в течение 24, 48, 72 и 168 ч.

Начальные колонии все круглые, цельные, гладкие, прозрачные и маслянистые.

2. Скошенный бульонный агар при

28 С в течение 24-168 ч (табл, 4).

Начальные колонии все нитевидные и маслянистые. о

3. Бульон при 28 С в течение

24-68 ч. У всех штаммов нет запаха (табл. 5).

4. Столбик бульонной желатины о при 20 С в течение 40 дней.

Все штаммы не разжижают. Рост —, вдоль оси столбика. 20 о 5. Лакмусовое молоко при 28 С в течение 40 дней.

Штамм SHS †20. Подкисление начинается в течение 7 сут. Слабая равномерная коагуляция начинается приблизительно на 18-й день и заканчивается на 38-й день. С 18-го по 32-й день верхний слой становится розовым, а нижний слой — серовато-коричневым, но на 32-й день весь слой равномерно 30 розовый.

У штаммов SHS-2004, 2005, 2006, 2007, 2008, 2010 и 2011 в течение периода инкубации не замечено никаких изменений.

6. Скошенный картофель при 28 С в течение 24-168 ч. Колонии у всех штаммов нитевидные, маслянистые и блестящие (табл. б).

В. Физиологические свойства (на основании результатов наблюдений при 28 С в течение 14 дней, если отсутствуют другие указания).

1. Нитрит. Все штаммы продуцируют нитрит из нитрата.

2. Нитратное дыхание. У всех не наблюдается ни рост, ни продуцирование газа в запечатанном парафином ,бульоне, содержащем 1% KNO .

3. Испытание с метилротом. У всех 50 положительный, за исключением штамма

SHS-20!0 (слабо положительный).

4. Реакция Votes-Proskanera (глюкоза). У штамма SHS-2003 — слабо 55 положительная. У штаммов SHS-2004, 2005, 2007, 2008, 2010 и 2011 — положительная. У штаммов SHS-2006 и

992 4

2009 †. отрицательная или слабо положительная.

5. Индол. У всех штаммов — отрицательная.

6. Сероводород.

Бактопептонная вода"свинцовоацетатная реактивная бумага - у всех положительная.

TSI-агар. У всех штаммов — отрицательная.

Агар Klieglera. У всех штаммов— отрицательная.

7. Аммиак. Все штаммы не продуцируют.

8. Гидролиз крахмала. Отрицательная у всех штаммов.

9 ° Рост на цитратных средах.

Среда Simmona, дополненная витаминной смесью. Рост — у всех штаммов .

Среда сhrrstensina. Рост у всех штаммов.

Рост на неорганических источниках азота.

Аммиак (среда — глюкоза Huckera, ! дополненная витаминной смесью). Рост . у всех.

Нитрат (среда — глюкоза Dimmika, дсполненная витаминной смесью). Рост наблюдается у штаммов SHS-2003, 2004, 2005, 2008, 2009, 20 10 и 2011 штамм

SHS-2006 не растет, а штамм SHS-2007 растет очень слабо.

11. Пигмент (культура штрихом на чашках Петри).

Синий пигмент (дрожжевой экстракт

17, глюкоза l%, СаСО 2% при 28 С в течение 7 дней). У всех негативная: отрицательная.

Розовый, способный к диффузии пигмент (среда аналогично приведенной), У всех штаммов — отрицательная.

Желтый пигмент (бульонный агар при 28 С в течение 7 дн.). У всех штаммов — отрицательная.

12. Уреаэа. У всех штаммов — отрицательная.

13. Каталаэа. У всех штаммов отрицательная.

1.4. Оксидаэа (скошенный бульонный агар, содержащий тетраметипфенилендиамин, в течение 18-24 ч). Отрицательная у всех штаммов.

15. Температурная эasèñèìîeòü (бактодрожжевой экстракт 0,57, бактопептон 0,57 и глюкоза 0,57., рН 7) представлена в табл. 7.

5 1190

16. Зависимость от р!! (глицерин

17, бактодрожжевой экстракт 0,57., бактопептон 17,, хлорид натрия 0,57,, в буфере 0,1 М 3,3-диметилглутаровой о кислоте, 28 С в течение 2-4 дней) 5 представлена в табл. 8.

17. Потребность в кислороде.

У всех штаммов — факультативная.

Палочковая культура, запечатанная жидким парафином. В этом случае среду глюкозà-ВСР, содержащую, 7: бактомясной экстракт 1, бактопептон 1, бактодрожжевой экстракт 0,2, хлорид.натрия 0,5, бромкрезол пурпурный 0,004 и порошок агара 1,5 15 (рН 7,0-7, 2), разлили в пробирки диаметром 18 мм и высотой около 8 см и стерилизовали при 121 С в течение о

15 мин. Столбики инокулировали до полного з атвердевания среды. Затем 20 пробирки запечатали стерильным жид.ким парафином (5-7 мл) на глубину о

4 см, культивировали при 28 С и наблюдали спустя 7 дней.

При значительном росте вдоль оси 25 палочек сверху до дна среды в течение 2-3 дней культура начала равномерно окрашиваться в бледно-желтый цвет, показывая отчетливую разницу в окраске каждого из приведенных в щ таблице.штаммов по сравнению с контрольной запечатанной неинокулированной пробиркой. С течением времени интенсивность желтой окраски возрастала.

3S

Анаэробная система газ-Рак (ВВ L).

Испольэовали чашку Петри с бактопитательным агаром, содержащим, 7.: бактомясной экстракт 1, бактопептон

1, хлорид натрия 0,5 и порошок агяра 1,5, или чашку Петри с агаром

I УР, содержащим, 7.: глицерин 0,5; бактодрожжевой экстракт 0,5; бактопептон 0,3; КН РО< 0,1; М880 7Н О

0,02; порошок агяра 1,5; рН 7,0-7,?.

Слабыч посев штрихом суспензии испытуемого организма культивировали о ,при 28 С в течение 48 ч после удаления кислорода путем двухчасовой. 59 реакции при 45 С в инкубаторе.

У всех штаммов наблюдался слабый рост, слабее чем у Escherichia

coli, взятой для контроля.

18 Тест открытого поля. У всех 55 штаммов — ферментативняя. Среду, содержащую, 7: бактотриптон 1:, бактодрожжевой экстракт 0,1; бромкрезол

992 пурпурный 0,004; глюкозу (нли лактоз у) 17. и порошок à-àðà О,,2; рН

7,0-7,2, разлили в пробирки (дия- е метр 18 мм) на глубину приблизительно 8 см и стерилизовали при 121 С о в течение 15 мин. После достижения температуры среды приблизительно о

30-40 С продублирована инокуляция для каждого организма из приведенных в таблице штяммов. Затем одну пробирку из каждой пары запечатали стерильным жидким парафином (5-7 мл) на глубину приблизительно 4 см, кульо тивировали при ?8 С и вели 3;\ ними наблюдение в течение 7 дней.

Продуцируют кислоту как в аэробных, так и анаэробных условиях из

D-глюкозы (а также из лактозы в случае .SHS-2003), газ не продуцирует.

Наблюдается отчетливый рост вдоль оси палочек сверху до дна как в запечатанной, так и в. незапечатанной культуре °

Продуцируют кислоту в аняэробных условиях не так быстро, кяк Fscherichia coli, взятую для контроля.

19. Продуцировяние кислот и газов из углеводородов показано в табл. 9 и 10.

20. Метиленовая синь (бульон, 18-24 ч). Все штаммы восстанавливают.

21. D-глюконовая кислота. Все штаммы используют.

22. 2-Кето-D-глюконовая кислота.

Используют все штаммы.

23. Продуцирование восстанов,";сн.ньгс соединений из сахарозы.Положительная у всех штаммов за исключением штамма SHS-2003.

24. Декарбоксилирование различных аминокислот.

D-глютаминовая кислота. Отрицательная у штяммов SHS-2003, 2008, 2009, 2010 и 2011; положительная у штаммов SHS-2004, 2005, 2006 и ?007.

Е-лизин. Отрицательная у всех штаммов.

L-аргинин. Отрицательная у всех штяммов.

L-орнитин. Отрицательная у всех штаммов.

25. Липаза. Отрицательная у всех штаммов.

26. Окисление глюконатя. Положительная у всех штяммов.

27. Разложение пектатя. Отрицательная у всех штаммов.! 190992

28. Гидролиз казеина. Отрицатель- ная у.всех штаммов.

29. Симплазмата. Отрицательная у штаммов ЯБ-2003, 2004, 2005, 2007, 2008 и 2009. Положительная у штаммов SHS-2006, 2010 и 2011.

30. D-Наза (бакто-D-наза испытуемый агар). Отрицательная у всех штаммов.

31. Фенилаланин-дезаминаэа (среда 10 фенилаланин/малоновая кислота). У штаммов SHS-2003, 2008, 2009, 2010 и 2011 отрицательная или слабоположительная; у штаммов SHS-2004, 2005, 2006 и 2007 отрицательная. 15

3?. Подавление KCN. Положительная у всех штаммов.

33. Рос-, в 5%-ном бульоне хлорида натрия. Положительный у всех штаммов. 10

34. Ауксотрофия (среда Grayand

Tatunia). Òðåáóåòñÿ никотиновая кислота или никотинамид всем штаммам..

35. Использование некоторых соединений (cpepa ОУ, 28 С, 20 и 44 ч, 25 встряхивание) представлено в табл. 11.

36 . . Уб их ино н .

Штаммы SHS-2003 и 2008 — убихинон-8 (и убихинон-7).

Штаммы 5НЯ-2004, 2005, 2006, 2007, 2009, 2010 и 2011 — убихинон-8.

Г, Происхождение.

Штаммы SHS-2003, 2004, 2006, 2007, 2010 и 2011 — мандарин благородный.

Штаммы ЯНБ-2005 и 2009 — хурма

35 виргинская.

Штамм SHS-2008 — почва.

Штаммы в табл. 1 определены путем сравнения упомянутых таксономических 40 свойств соответствующих штаммов в табл. 2 с известными.

1. Распределение в,пределах семейства.

На основании описанньп: результа- 45 тов наблюдения можно сделать вывод, что все приведенные в таблицах штаммы являются короткими палочками грамотрицательных и факультативных анаэробов, которые не образуют споры 50 и проявляют каталаэную активность,. но не обладают оксидаэной активностью, они отнесены к семейству

Entегоbacterialoeae.

2. Распределение в пределах рода. 55

Ксе приведенные в таблицах штаммы отнесены к роду Erurieia на основании таксономических свойств, в частности они продуцируют кислоты из .Р-метилглюкозида и сахароэы (за исключением штамма SHS 2003, который не продуцирует кислоту из сахароэы, но использует последнюю в качестве единственного источника углерода), но не из адонита, дульцита или мелецитозы, не используют бензоат, оксалат и пропионат, не способны гидролизовать крахмал, не способны декарбоксилировать глутаминовую кислоту, аргинин, лизин и ортинин (за исключением штаммов SHS-2004, 2005 и 2007, которые декарбоксилируют глутаминовую кислоту) и не проявляют уреазной или липазной активности.

3. Распределение в пределах вида.

Хотя штамм SHS-2003 считается близким к Erwinia stewartu группы

herbicola на основании отсутствия жгутикования, однако у него имеются другие таксономические свойства, сильно отличающиеся от свойств

Erwinia stewartu в потребности в никотиновой кислоте или никотинамиде для роста, в продуцировании сероводорода из цистеина, в восстановлении нитратов в нитриты, в непродуцировании кислоты из сахарозы (хотя он не может продуцировать кислоту из сахарозы, однако использует сахарозу в качестве единственного источника углерода), арабинозы, рафиноэы или сорбита, в продуцировании кислоты из салицина, целлобиозы и глицерина, в неиспользовании тертраты в качестве единственного источника углерода.

Кроме того, так как этот штамм не показал совпадения с любыми другими известными видами рода, его следует отнести к новым видам, предлагаемого изобретения Erwinia Citreus

Хотя штаммы SHS-2004, 2005, 2006 и 2007 считаются близкими к Erwinia

stewartu с точки зрения отсутствия жгутикования, однако они обладают таксономическими свойствами, сильно отличающимися от свойств Erwinia

stewartu в потребности в никотиновой или никотинамиде для роста, в продуцировании сероводорода из цистеина, в восстановлении нитратов в нитриты, декарбоксилировании глутаминовой кислоты. Кроме того, они не продуцируют кислоты из арабинозы, маннита, лактозы или сорбита, но продуцируют кислоты из салицина и целлобиозы и не используют тартраты

1190992

10 н качестве единственного источника. углерода, Кроме того,- эти штаммы -отличаются от описанного штамма SHS-2003 тем, что декарбоксилируют глутаминовую кислоту, почти не используют лактозу, ацетат и лактат в качестве единственного источника углерода, не продуцируют кислоты из маннита и лактозы, не обладают активностью к лакмусовому f0 молоку.

Поскольку эти штаммы не показали совпадения с любыми другими известными видами рода, их следует отнести к новому виду, названному Erwinia punc-f5 tata.

Из этих штаммов штаммы БНЯ-2004 и 2006 не продуцируют кислоту из рафинозы и не используют маннит, ацетат или лактат. 20

Но штамм SHS-2004 отличается от штамма SHS-200б тем, что продуцирует ацетоин из глюкозы, использует нитрат в качестве источника азота, продуцирует кислоту из глицерина и использует формиат в качестве единственного источника углерода.

Штамм SHS-2005 как и штамм

SHS-200б почти не способен использовать маннит, ацетат и лактат в качестве единственного источника углерода, однако первый отличается от последнего тем, что продуцирует кислоту из глицерина, ацетоин из глюкозы, образует флуоресцирующие пигменты в среде King B .почти не продуцирует кислоту из рафинозы и использует формиат в качестве един-. ственного источника углерода.

Кроме того, штамм SHS-2007 и 40 штамм SHS-200б почти не способен использовать маннит, ацетат и лактат в качестве единственного источника углерода, однако первый отличается от последнего тем, что продуцирует 45 кислоту из рафиноэы, ацетоин из глюкозы, использует формиат как единственный источник углерода и имеет широкий диапазон температуры роста 4,0-47,5 С 50

На основании укаэанных результатов наблюдений все штаммы $НЯ-2004, 2005„ Erwinia

punctata и.каждый из них представляет вариант по отношению к осталь- 55 ным.

Хотя штаммы SHS-2008 и 2010 близки к Erwinia tracheiphila или

Erwinia guereina с точки зрения их подвижности с монолатеральным жгутиком, но их таксономические свойства сильно отличаются от свойств Erwihia

tracheiphila в следующем: рост при о температуре выше 36 С, обильный рост на бульонном агаре, показывают мукоицный рост, восстанавливают нитраты в нитриты, продуцируют кислоты из салицина, ксилозы, мелибиозы и маннозы и используют лактат в качест ве единственного источника углерода.

Кроме того, имеются различия между их таксономическими свойствами и свойствами Frwinia guerina в том, что они окисляют глюконовую кислоту, восстанавливают нитраты в нитриты, продуцируют кислоты из мелибиозы и целлобиозы, не продуцируют кислоты из маннита, М -метилглюкозида, эзуклина и сорбита, не продуцируют газ на глюкозопептонной среде.

Кроме того, поскольку эти штаммы не совпадают ни с какими другими известными видами рода, целесообраз-! но отнести их к виду. Erwinia.

Штамм SHS †20 показывает значительное совпадение со.штаммом

SHS-2008 за исключением некоторых различий, которые заключаются в том, что он не продуцирует кислоту из глицерина, SHS-2008 продуцирует кислоту иэ рибозы, а SHS-2010 почти не продуцирует ее. Кроме того, у него слабо положительная реакция в тесте с метилротом и он образует флоуресцирующие пигменты на среде.

Штамм SHS-2009 близок к Erw!nba

tracheiphila, Е. guerceina u

E. herbicola с точки зрения цоцвиж— ности с монола-.еральным жгутиком.

Однако имеется заметная разница между таксономическими свойствами этого штамма и свойствами Erwinia

tracheiphila в том, что наблюдается обильный рост на бульонном arape, о рост при температуре выше 36 С. Кро-. ме ",îãî, он показывает мукоидный рост, восстанавливает нитраты в нитриты., продуцирует кислоты из салицина, ксилозы, мелибиозы, целлобиозы, глицерина и маннозы.

Найдено также заметное отличие от свойства Erwinia guereina в окислении глюконата, восстановлении нитратов в нитриты, слабом образовании ацетоина и глюкозы, продуцировании кислот из ксилозы, мелибиозы и целлобиозы.

1190992

Кроме того он не продуцирует кислоту иэ маннита,еС -метилглюкоэида, эзуклина, рибозы или сорбита, не использует тертрат в качестве единственного . источника углерода и не продуцирует 5 газ на глюкозопептонной среде.

Отличия свойств штамма БНБ-2010 от свойств Erwinia herbicola var

herbicola состоят в его потребности в никотиновой кислоте или никотина- 1© миде для роста, в слабом образовании ацетоина из глюкозы, он не разжижает желатину, продуцирует кислоты из мелибиозы, целлобиозы и глицерина, не продуцирует кислоты из арабинозы, маннита, мальтозы, декстрина, рамнозы, рибозы или сорбита.

Хотя остаются еще некоторые различия при сравнении этого штамма с ранее определенным штаммом _#_, SHS-2008 в слабом образовании ацетоина из глюкозы, в непродуцировании кислоты из рибозы, однако первый штамм . совпадает с последним по другим ,преобладающим свойствам и, следо! вательно, идентифицирован как вариант определенного ранее штамма.

Штамм SHS-2011 близок к Erwinia

tracheiphila или Erwinia amylavara с точки зрения подвижности с моноатеральным жгутиком .

При сравнении свойств этого штам-. ма со свойствами Erwinia tracheiphi1a различия состоят в его умеренном росте в бульонном агаре, росте при температуре выше 36 С. Кроме о 35 того, он показывает мукоидный рост, восстанавливает нитраты в нитриты, продуцирует кислоты из салицина, ксилозы, мелибиоэы, целлобиозы и манноэы и использует лактат в количестве единственного источника углерода °

При сравнении свойств этого штамма со свойствами Erwinia amylovola различия состоят в образовании серо- водорода из цистеина, росте при температуре 36 С и выше, восстановлении нитратов в нитриты. Кроме того,. он не разжижает желатину, продуци|рует кислоты из салицина, ксилозы, мелибиозы, целлобиозы и маннозы, не продуцирует кислоту из рибозы, При сравнении со штаммом SHS-2008 этот штамм совпадает с последним по свойствам, однако не продуцирует 5S кислоту из рибоэы или глицерина и идентифицирован как вариант опреде= ленного ранее штамма.

Определенные микроорганизмы обильно растут в водной питательной среде, содержащей D-глюкозу в качестве основного источника углерода, настой кукурузы в качестве источника азота и небольшое количество неорганических солей. Если их культивируют в аэробных условиях, они растут на среде с очень большой концентрацией D-глюкозы с достаточной стабильностью для продуцирования 2,5-дикето-D-глюконовой кислоты (2,5-ДКГ) с хорошим выходом по сравнению с известными микроорганизмами, применяющимися для получения этого продукта.

Концентрация D-глюкозы в бульоне может достигать при необходимости

40 об.%, хотя с экономической точки зрения целесообразно для получения

2„5-дикето-D-глюконовой кислоты поддерживать концентрацию D-глюкозы в интервале 15-25 об.%, более предпочтительно 20 об. .

Температура сбраживаемой среды

15-35 С предпочтительно 20-30 С и о может составлять 28 С. Начальные значения рН среды должны быть в интервале 5,5-7,5, предпочтительно

6,0-7,0.

Значения рН среды можно поддерживать во время ферментации в требуемом интервале 4,0-5,5 путем введения неорганических солей„ например карбоната кальция, обладающих буферным действием, в исходную среду или введением оснований, например гидроксида натрия, в среду по мере протекания процесса ферментации.

Инокулированную сбраживаемую среду следует непрерывно перемешивать .мсшалкой (приблизительно 1740 об/мин) при аэрации в количестве приблизительно 600 Н. мл/мин.

Брожение заканчивается спустя

17-31 ч с начала процесса, когда превращение D-глюкозы в 2,5-ДКГ достигает значения, которое соответствует выходу приблизительно 90 .

Накапливающаяся 2,5-ДКГ или ее соли могут быть выделены из культуральной жидкости в виде кристаллов после обработки любым способом, например регулированием рН, или среда может быть успешно использована как таковая в качестве питательной среды на следующей стадии.

Например, среда, содержащая.,2,5-ДКГ, может быть непосредственно йримене1,0

0,02

Сбраживаемую среду (водный раствор) готовят следующего состава, об.7:

13 11909 на для получения 2-кето-1.-гулоновой кислоты. Таким образом, последняя может быть получена с большим выходом по упрощенной технологии.

Предлагаемый способ может быть также практически осуществлен путем простîro контактирования любого из продуктов, полученных обработкой клеток указанных микроорганизмов, с любым из субстратов, содержащих 10

D-глюкозу.

II р и м е р 1. Для посева используют среду (водный .раствор), содержащую, об.Ж:

D-глюкоза (гидра- 15 тированная, содержание 91Z)

Настой кукурузы (СSL) 5,0

Дигидрофосфат 20 калия (КН РО ) 0,1

Сульфат магния (NgSO4 7Н О)

Карбонат каль- ция (CaCO ) 0,5 .25

Среду доводят до рН 6,8-7,0 при помощи 107-ного водного раствора едкого натра, делят на порции по

50 мл и помещают в стерилизованные конические колбы емкостью 500 мл. З0

Каждую порцию среды в колбе инокулируют полной петлей. одного из штаммов, приведенных в табл. 3, и встряхивают (ход 71 мм, 270 ударов в минуту) при температуре 28 С в течение приблизительно 8 ч. Культивирование заканчивается, когда оптическая плотность (OD) среды достигает приблизительно 8 (конечная точка).

Таким образом получают культуру для посева.

92 24

Температура, ОС 28

Перемешивание, об/мин 1740

Азрация, Н. мл/мин 600

Продолжительность, ч 17-31

Полученный продукт хроматографируют на носителе фильтровальной бумаги путем капиллярного поднятия и коколичественно определяют пятна методом денситометрии. При этом используют носитель Тоуе Roshi У 50 и проявляющий растворитель — фенол муравьиная кислота : вода, взятые в соотношении 75 : 4 : 25.

Для проведения окрашивания набрыз— гивают раствор насыщенного водой н-бутанола (100 мл), содержащего анилин (0,93 г) и фталевую кислоту (1,66 г), и проводят последующую обработку при 105 С в течение 2 мин для проявления окраски. Результаты представлены в табл. 12.

Кроме того, проведена также тон- . кослойная,хроматография с ТЬС а11иmisheet cello1ose и с описанными системой проявляющего растворителя и методикой окраски. В этом случае определение осуществляют путем сравнения хроматограмм с хроматограммами, полученными для аутентичных экземпляров.

Брожение заканчивается, когда розовое пятно 2-кето-Р-глюконовой кислоты исчезает с указанной бумаги или с тонкослойной хроматограммы.

Результаты, полученные после инкубации штаммов, представлены в табл. 13.

IT р и м е р 2. Продуцирование с применением суспензии клеток и сырого экстракта фермента. Для получения клеток микроорганизмов используют среду (водный раствор) следующего состава, об.Ж:

КН2РО4 0,1

Na2SO4 7Н20 О. 02

CaCO 0,6

Доводят рН сбраживаемой среды до 6,8-7,0, делят на порции по

455 мл и помещают в ферментеры емкостью 1 л. В каждый из ферментеров добавляют по 45 мл указанной среды для посевай Затем осуществляют сбраживание при .следующих условиях:

D-глюкоза

CSL

КН РО

CaCO g

20,0

3,0

0,1

6,3

Среду доводят до рН 7,0, делят на порции по 80 мл и помещают в кони50 ческие колбы емкостью 500 мл.

Каждую иэ указанных сред инокулируют соответствующим штаммом (табл.4) по способу, описанному в примере 1, и встряхивают (ход 71 мм, 270 ударов

55 в минуту) при 28ОС в течение 16 ч.

После встряхивания клетки микроорганизмов отделяют центрифугированием культуральной среды, дважды

Таблица

Штамм

SHS

АТСС

Микроорганизм

FERM-P

5449

31623

5452

31626

2004.

5450

31624

31625

2005

5451

2007

5453

31627

31628

5454

2009

5455

31629

2010

5456

31630

2011 -и5457

31631

Таблица 2

2003

О,8-1,2х1,0-2,9

1,0-1,5х1,5-3,3

2004

То же промывают соленым раствором и делят на две части.

Одну из указанных частей суспендируют снова солевым раствором и получают суспензию клеток. Вторую часть суспендируют в буфере 1/50 М трис-НС1 (рН 7,5), измельчают ультра звуком, центрифугированием удаляют нерастворимый остаток и получают сырой ферментный экстракт в виде .всплывшего слоя.

Затем осуществляют инкубации с клеточной суспензией и с сырым ферментным экстрактом соответственно.

При инкубации с клеточной суспензией готовят смесь из буфера

0,1 M 3,3-диметилглутаровой кислоты (рН 5,0), содержащего приблизительно 5 об.X D-глюкозы, в которой концентрацию клеток регулируют так, чтобы OD при 660 м ц была приблизительно 10. Смесь делят на порции по 10 мл, помещают в пробирки 23 мм (диаметр) х 196 мм (высота) и ино кубируют при 28 С в течение 3 ч.

Затем смесь дентрифугируют, образуется всплывший слой, который

2003 Erwinia citreus

2006 Erwinia punctata

2008 Erwinia terreus

190992 16 анализируют методом бумажной хромата графин.

Результаты, полученные после инкубации с клеточной суспензией, а также концентрация D-глюкозы в смеси до инкубации представлены в табл. 14.

При инкубации с сырым ферментным экстрактом к смеси, приготовленной аналогично описанному, добавляют

10 сырой ферментный экстракт так, чтобы его концентрация, выраженная количест4 вом протеина, составляла 0,25 мг/л.

После встряхивания аналогично описанному смесь обрабатывают двумя

f5 каплями 10Х.-ного раствора трихлоруксусной кислоты для удаления протеиновой части и хроматографируют на . фильтровальной бумаге. Результаты, полученные после инкубации с сырым

20 ферментным экстрактом, представлены в табл. 15.

Таким образом, предлагаемый способ обеспечивает высокий выход

2-кето-D-глюконовой кислоты за

17-31 ч ферментации, что ускоряет и упрощает процесс ее получения.

Наблюдались Наблюдались 1,6х6,0-7,0

То же 0,7-0,8х4,0-5,0

1190992

Продолжение табл.2) ь

2005

0,7-0,8х2,4-3,0

2006

0,6-0,8х2,4-2,7

Не наблюда- Не наблюдались

2007 . лись

2008

То же

То же

2009. 2010

2011

Таблица 3

Штамм Состояние

SHS поверхности

Развитие культуры (изменения) Окраска

2003 Блестящая

2004 То же

Бледно-красно-желтая

Выпуклая

Бледно-бежевая

2005

То же

2006

2007

2008 От тусклой Бледно- красно-желтая до блестящей

2009 Блестящая

Бледно-бежевая

2010 То же

То же

2011

Бледно-красно-желтая

1,0-1,3х1,5-2,1

1а1 1,3х1,3-1,9

1,0-1,2х1,7-2,3

О, 8-0, 9х1, 5-1, 7

1,0х1,2-2, 1

1, Ох 1, 0-2, О f2)

1,0х1,3-2, О

Гладкая, но постепенно меняется на шероховатую

Выпуклая, но постепенно меняется на рельефную

Выпуклая, но постепенно меняется на взгорбленную

Рельефная, но постепенно меняется на взгорбленную

Гладкая, но постепенно меняется до шероховатой и выпуклой

Гладкая, но постепенно меняется до шероховатой и рельефной

Выпуклая, но постепенно меняется до взгорбленной

Выпуклая, но постепенно меняется до плоской. Липкая, но постепенно меняется до маслянистой.

1190992

19

Таблица 4

Развитие культуры (изме-, нения) Рост Состояние

Окраска

Штапп

SHS поверхности

2003 Обильный Блестящая

Бледно-красно-желтая

От тусклой Бледно-бежевая до блестящей

Тусклая, но постепенно изменяется до блестящей

2004 То же

Блестящая

Бледно-бежевая

2005 Умеренный

От тусклой Бледно-красно- Тусклая, но постепенно до блестящей . -желтая изменяется до блестящей

2006 То же

То же

2007 Недоста- Тусклая точный

2008 Обильный От тусклой до блестящей

Тусклая, но постепенно изменяется до блестящей 2009 То же

То же

То же

2010 Умеренный Блестящая

2011 То же То же

Таблица 5

Рост поверхности культуры

Штамм

SHS

Глчбинный рост

Кольцо Мембранный вокруг рост пробирки

Помутнение Осаждение хлопьев

Рост хлопьев

Слабое

Недостаточное

2004

На 6-й день

От слабого до умеренного

2005

Слабое

2006

2007 На 3-й день

На 7-й день

Слабое

На 3-й день

2008 На 7-й день

То же

2003 На 3-й день и после

От слабого до умеренного

Начальное компактное осаждение изменяется до слабого осаждения хлопьев

Недостаточное

То же

1190992

Продолжение табл.5

Глубинный рост

Рост поверхности культуры

Ослжленпе хлопьев

Помутнение

Рост хлопьев

Кольцо 2"2ембранный вокруг рост пробирки

На 3-й,—

6-й

2009

Слабое

Недостаточное день

2010

На 6-й день

От слабого То же до умеренного

На 4-й день

2011

Слабое

Таблица 7

Таблица 6

Штамм ТемпераБНЯ тура роста, ОС

Оптимальная

Рост

Окраска температура о роста, С

2003 Обильный

Бледно-красно-желтая

2004

Бежевая

35 2005 6,5-38,5

2006 6,5-38,5

2005 Умеренный

2006

Бледно-бежевая

2007 4,0-47,5

2007

Бежевая. 21-27

2008 . Обильный

19,5-32,5

2009

24-30

2010

Умеренный

20-34

19,5-24

2011

Штлмм

T S2lS

Штамм

SHS

На 7-й день

2003 8,5-38,5

2004 6,5-40,0

2008 .18,0-40,0

2009 8,5-38 5

2010 6,5-40,0

2011 4,0-40,0

1 8-31

20-34

22-28

21-28

?4

1190992

Та блица й

Оптимальньй рН роста

Штамм

SHS рН роста

6,0-7,5

6,0-7,5

6,0-7,5

2003 5,5-8,0

2004 5,5-8,5

2005 5,5-8,5

2010 6,0-8,0

2011 5,5-7,5

Таблица 9

ФрукЦел- Глило- цебио- рин

КсиСалицин

ЛакМелиИан-ме- Иан- РибоГлю- Га—

Штаммы

SHS толо— нит тоза биоза за

2003

+ + + + + + 4 + + +

2004

+ + +

+ + + + + + — +

2005

+ + + + + + + +

+ + + — + + + +

2006

+ + +

2007

+ + +

+ + 4 + + + +

2008

+ + + + + + + +

2009

+ + +

?010

+ + 4 +

2011

+ + 4 + +

2006 5 5-8, 5

2007 5, 5-8,5

2008 5,5-7,5

2009 5,5-8,0 ко- лак- тил- но- за за тоза клю- за ко6,0-7,5

6,0-7,5

6,0-7,5

6,0-7,5

6,0-7,5

6,0-7,5

+ + + + +

1 l 90992

Таблица 10

ДульСорбит

АрабиДекстрин

РаМелезитоСахаАдонит

ИноШтаммы

SHS

Мальтоза

Рамноза

Эзуклин финозит цит ноэа за роэа за

2003

2004

2005 +

2006 +

2007 +

2008 +.

2009 +

2010 +

2011 +

П р и м е ч а н и е. Продуцирует кислоту без газа (+); не продуцирует ни кислоту, ни газ (-) слабо продуцирует кислоту без газа (+).

Т,а блица 11

Тартрат

ЛакПропиоБен- Га-. Ма" Оксазо- ла- ло- лат ат ту- нат

СукМалеФормиат

ГлюкоЦитрат

АцеШтамм

SHS тат ци,нат матат нат нат ат рат ронат

2003 + + + + +

+ +

+ +

2011 + + +:+ + + +

П р и м е ч а н и е. Использует в качестве единственного источника углерода (+); слабо использует или не использует в качестве единственного источника углерода (+); не использует (-), 2004 т- + + + + + +

2005 s + + + + + +

2006 i + + + + + +

2007 + + + + +

2008 - + + + . +

2009 + + + + +

2010 + + + + +

-метил.глюкозид

ll90992

Таблица 12

Цвет Rf

Вещество

2,5- Дикето-D- Коричне- 0,16-0, 18

-глюконовая вый кислота

Розовый 0,27-0,29

Коричневый

D-глюкоза

0,48-0,50

Таблица 13

Посевная культура по скончании процесса культивирования

Штаммы

SHS

Сбраживаемая культура

2,5-Дикето-D-глюко" новая кислота

По окончании процесса сбраживания

OD Продолжительность, ч рН рН OD

5,4 12,3

4,9 12 0

5,1 12,6

2003

19

2004

19

89

4,7 12,0

4,9 12,6

7,0

6,0. 2007

5,3 12,4 29

17

2008

3,1

5,6

21,5, 8

5,7 12,4

5,4 12,8

5,1 12,2

10

3,4

2009

2010 5, 4

18

2,5

31

2,4

2011

Таблица 14

2,5-Дикето-D-глюконовая кислота, Х

2-Кето-D-глюкоШтамм SHS новая кислота, Ж

До инкубации После инкубации

1,9

0,8

2,7

4,9

2003

0,7

1,5

1,9

5,0

2004

7,0 10,0

6,0 8,5

2005 6,9 9,5

2006 59 75

2-Кето-D— глюконовas кислота родолжительность, ч/об

Концентрация, об.7

Выход по

D-глюкозе, Х

ll90992

Продолжение табл.l4

2-Кето-D-глюкоГлюкоза, %

До инкубации

После инкубации

2005

5,0

2., 6

0, 6

0 7

2006

5,0

1,9

0,9

1,4

2007

5,0

1,4

0,3

1,3

2008

5,0

0,8

1,2

2009

5,2

1,9

0,7

1,3

2010

5,0

2,9

0,5

0,9

2011

5 0

0,7

0,.9

Таблица 15

2003

1,0

2,0

2004

0,6

0,8

2005

0,4

0,4

2006

0,5

0,5

0,3

2007

0,4

0,8

2008

0,5

0,6

0,4

2009

0,3

2010

0,3

2011

0,3

0,3

Составитель М. Андреева

Редактор Л. Гратилло Техред А.Ач Корректор В. Гирняк

Заказ 7012/63 Тираж 524 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР ло делам изобретений и открмтий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4

Штамм

Я!Б

6!тамм SHS

2-Кето-D— глюконо" вая кислота, % новая кислота, %

2,5-Дикето-D-глюконовая кислота, %

2,5-Дикето-D-глюконовая кислота, %