Штамм @ @ 80,используемый в качестве продуцента сайт- специфической эндонуклеазы @ @ .

 

Штамм Bacillus brevis-BO ВКМ R-2 D (коллекция Всесоюзного института биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР), используемый в качестве продуцента сайт-специфической эндонуклеазы Вв vll.

CQIO3 СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

flO ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

„„SU„„1190642 А (59 4 С 12 N 15/00, 9/00,С 12 R 1/08 (21) 3735472/28-13 (22) 29.04 ° 84 (46) 30. 12.86. Бюл. ¹ 48 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт прикладной микро-. биологии и Институт белка АН СССР (72) З.Ф.Бунина, В.М.Крамаров, Н.И.Матвиенко, Д.М.Пачкунов, В.В.Смолянинов и А.Л.Мазанов (53) 615.779.94(088.8) (56) Gingeras Т.R., Nilazzo 1.R., Roberts R.I. Nucl. Acids Res. 5, № 11, р. 4105-4127., 1979, (54) ШТАММ BACILLUS BREVIS-80, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ В КАЧЕСТВЕ ПРОДУЦЕНТА

САЙТ-СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ

Вв vII. (57) Штамм Вас llus brevis-80 В ВКИ

R-2 Р (коллекция Всесоюзного института биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР) ° используемый в качестве продуцента сайт-специфической эндонуклеазы Вв vII.

1190642

50 ки.

490 Подписное

Произв.-полигр. пр-тие, r. Ужгород, ул. Проектная, 4

Изобретение относится к биологической промышленности и представляет собой штамм, продуцирующий сайтспецифическую эндонуклеазу Вв vII используемую как инструмент для получения фрагментов ДНК, картирования молекул ДНК и конструирования векторных молекул ДНК.

Целью изобретения является получение штамма Bacillus brevis-80,продуцирующего сайт-специфическую эндонуклеазу Вв vII, которая необходима для создания новых типов рекомбинантных молекул ДНК.

Штамм Bacillus brevis-80 характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки.

Пряьые палочки, подвижные, имеют

2-4 жгутика, расположенные терминально и латерально. Величина клеток односуточной культуры на мясо-пептоннам агаре 0,4-0,6х1-1,4 мкм. Споры эллипсовидные, имеют отчетливую раздутость спорангия, расположены суЬтерминально. Клетки хорошо окрашиваются основным фуксином. Грамположительные, каталазоположительные.

Культуральные признаки, На тверцом пептоно-глюкозном агаре после 24 ч инкубации в термостате при 32 С образуются круглые колоо иии 0,5-1,5 мм в диаметре, блестящие с ровными краями, гладкие, влажные, выпуклые, пастообразные, бесцветные, легко снимаются и размазываются по твердой поверхности. Рост на жидкой питательной среде характеризуется равномерным помутнением. Хорошо растет на минеральной среде. Опти-! о мальная температура роста 30-37 С.

При 3, 5, 10, 20 и 65 С культура не растет. При 25 и 50 С рост слабый.

Физиолого-биохимические признаАэроЬ. Желатину разжижает,индол не образует, при росте вьщеляет сероводород. Хорошо усваивает глюкозу и ксилозу с образованием кислоты.

Усваивает инозит, лактозу, фукозу, сорбит, мальтозу, дульфит, маннозу, маннит, рибозу„ Не усваивает саха- . розу и арабинозу. Минимальный рН 5,2, максимальный 12,0. Оптимум рН 7,5ВНИИПИ Заказ 7141/4 тираж

8,0. Растет при 57.-ном NaC1 и

0,001/-ном лизоциме, при 77.-ном

NaC1 и 0,02Х-ном азиде Na не растет, Культура хранится в пробирках на агаризованной среде под вазелиновым маслом. штамм продуцирует сейт-специфическую эндонуклеазу Вв vII узнающую на двухнитевой ДНК последовательность нуклеотидов 5 — GTACTTC-3.

) t

3 — CAGAAG-5

Пример. Получение сайт-специфической эндонуклеазы Вв vII.

Ытамм Bacillus brevis-80 хранится в пробирках на агаризованной среде под вазелиновым маслом. Для оживления

Bacillus brevis-80 пересевается на скошенный агар со средой М - 1, содержащей, г/л: (ИН„)дНРО» 1,0; КС1

0,2; Mgs04 7Н О 0,2, дрожжевой экстракт 0,2, агар 1,5, глюкоза 5 (добавляется после стерилизации).,рН 7,5 и инкубируют в термостате при 37 С в течение 24 ч. Затем делают второй пассаж на скошенный агар со средой

Р 1.

Для получения жидкого инокулята пробирку с 5 мл среды М 2, содержащей, г/л: пептон 5, дрожжевой экстракт 3, NaC1 3, (NH ) НРО 1,0, MgS0 7Í О 0,2, глюкоза 10, рН 7,88,0, вода дистиллированная, вносят петлей культуру после второго пассажа .на скошенном агаре и инкубируют

15-18 ч при 37 С. Оптическая плотность суспензии клеток составляет

0,6-0,8 о.е. Полученный инокулят засевают в круглую колбу общим объемом 4 л, содержащую 2 л питательной среды В 2, перемешивают среду на магнитной мешалке в термостате при 37 С, Культуру растят до средней логарифмической фазы, оптическая плотность суспензии клеток составляет 0,3 о.е.

Культуральную жидкость охлаждают до

4 С, биомассу собирают центрифуги-. рованием при 10000. С 1 л жидкой питательной среды получают 0,4 г сырой биомассы. Из 1 г биомассь1 хроматографией на ультрагеле АсА-44 .и гепаРин-агаРозе вьщелили 1РРР ед. эндонуклеазы Вв v II