Штамм @ @ @ 1672-продуцент холерного токсина

 

Штамм Escherichia coli KS1672 № 50 (коллекция Научно-исследовательского института эпидемиологии им. Н.Ф.Гамалеи)- продуцент холерного токсина.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) (И) )) 4 С 12 N 15/00

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 3733683/28-13 (22) 26.04.84

° (46) 07.06,87. Бюл. У 21 (71) Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи (72) А.Л.Гинцбург, Н.В.Янишевский, И.А.Шагинян, В.Л.Мотни, Ю.В.Вертиев и Г.Б.Смирнов (53) 576.093.1(088.8) (56) Gennaro М.Ь. et al, Nucleic

Acids Research, 1982, 10, р. 4883. (54) ШТАММ ESCHERICHIA C0LI KS1672ПРОДУЦЕНТ ХОЛЕРНОГО ТОКСИНА (57) Штамм Escherichia coli К81672

В 50 (коллекция Научно-исследовательского института эпидемиологии им. Н.Ф.Гамалеи)- продуцент холерного токсина.

1 11906

Изобретение относится к медицине и ветеринарии, а именно к получению непатогенного штамма Е. coli, продуЩирующего холерный токсин.

Цель изобретения — создание генноинженерным способом непатогенного для человека и животных штамма с повышенной продукцией холерного токси„на.

Пример. Предлагаемый штамм 10

Е. coli KS1672 является непатогенным для человека и животных и синтезирует не менее 1 мг холерного токсина на 1 л культуральной среды.

Штамм KS1672 создан на основе хорошо изученного лабораторного штамма НВ 101 (Г, Г, RecA производного штамма Е. coli К-12), широко используемого в генетических экспериментах.

Этот штамм йе может колонизировать 20 кишечник человека или животных — место действия холерного токсина — и не выживает при совместном культивировании с нормальной кишечной микрофлорой.

Штамм KS1672 содержит гибридную плазмиду рСТ110, детерминирующую синтез холерного токсина. Плазмида рСТ 110 создана на основе векторной плазмиды рВК 322. Донорной ДНК слу- З0 жит хромосомная ДНК, выделенная иэ

Ч:cholerae RV 79. Конструирование плазмиды рСТ110 осуществляют с помощью рестрикционной эндонуклеазы

Pst 1. Полученная. гибридная плазмида 35 содержит вставку размером 5,7 тысяч нуклеотидных пар. Количество копий плазмиды рСТ110 на одну клетку штамма KS 1672 составляет 15.

Штамм Е.coli KS1672 хранится в коллекции Научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи АМН СССР под регистрационным номером 50.

Характеристика штамма.

Морфологические признаки. Клетки . прямые, палочковидной формы, 1, 1-1,5х х2,0-6 мк, подвижные, с перитрихиальными жгутиками, грамотрицательные, >0 неспорообраэующие, кислотонеустойчивые, оксидазоотрицательные.

Культуральные признаки. Хемоорганотрофы. Метаболизм дыхательный и бродильный, каталазо-положительные.

Среда Эндо. Колонии бледно-розового цвета, блестящие, с ровными краями, через 24 ч достигают 1,0—

1,2 мм в диаметре.

40 2

Мясо-пептонный агар. Колонии беловатого оттенка, вязкой консистенции, гладкие, круглые, прижатые, с ровны- . ми краями.

Кровяной агар. Колонии бледно-серого цвета, круглые, с ровными краями. Гемолиэ не выявлен.

Среда Эванса. Аэробные условия вы ращивания. Через 5 ч образуют муть .

Через 15 ч на дне пробирки появляется микробная взвесь сероватого цвета.

Мясо-пептонный бульон. Аэробные условия выращивания. Через 6 ч образуют ровную интенсивную муть. Через

24 ч на дне пробирки появляется микробная взвесь серовато-белого цвета..

Казамино-дрожжевой бульон. Через о

18 ч при 30 С образуют ровную интенсивную муть. физиолого-биохимические признаки.

Бактерии штамма Е. coli KS1672 растут о в пределах от 5 до 43 С при оптимуме—

37 С и рН 6,8. В качестве источника углерода используют многие углеводы, спирты, органические кислоты. Глюкоза, мальтоза, арабиноза, рамноза и другие углеводы сбраживаются с образованием пирувата.

Бактерии в качестве источника азота используют как минимальные соли в аммонийной и нитратной форме, так и в органической форме в виде пептона, аминокислот. Желатину не разжижают. Уреазной активностью н обладают. Индола не образуют. Устойчивы к тетрациклину (20 мкг/мл). Непатогенные для лабораторных животных.

Для количественного определения холерного токсина используют иммуноферментативный метод. В качестве контроля и для определения чувствительности метода используют очищенный препарат холерного токсина.

Бактериальные клетки объемом 50 мл о .выращивают 18 ч при 37 С в 0,5-лит-,, ровых колбах в среде, содержащей

ЗХ-ные каэаминовые кислоты и 0,5Х-ный дрожжевой экстракт при рН 7,7-7,8.

Клетки осаждают центрифугированием и ресуспендируют в 0,05М трис HC} рН 8,6 с 0,2 N NaCl. Клеточную суспензию подвергают озвучиванию в ультразвуковом дезинтеграторе. Используют последовательные. двухкратные разведения клеточных лизатов.

Пробы инкубируют в течение 1 ч с сенсибилизированной гаиглиозидами поверхностью лунок микроплат. ИнкубаТехред Н.Глущенко Корректор А;Ильин

Редактор П.Горькова

Заказ 2681/1

Тираж 499 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5 производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 3 11 цию с антитоксической противохолерной сывороткой, разведенной 1:200, проводят в течение 18 ч при комнатной температуре. После промывания

0,05 М фосфатным буфером рН 7,2 в лунки добавляют по 0,2 мл раствора иммуноферментных конъюгатов в разведении 1:300. Конъюгаты состоят из

F as -фрагмента антител барана к иммуноглобинам кролика и пероксидаэы.

Реакцию учитывают через 30 мин после добавления субстрата — 0,0033 перекиси водорода в 0,15 М NaCl u

П-фенилендиамина. При двухкратной раститровки клеточных лиэатов исход-. ного штамма Ч. cholerae RV 79 положительная реакция наблюдается в разведении 1:128. В то же время лизаты клеток штамма KS1672 дают положительный результат в разведении

1:1024. Чувствительность метода

Gm, ELISA составляет в данной серии опытов 1 нг/мл. В соответствии с ус90640 4 тановленной чувствительностью метода и подсчетом числа выросших в процессе культивирования микробных клеток рассчитывают количество продуцируемого холерного токсина у исследуемых штаммов. Штамм V.ñhîlåràåR×79 продуцирует 0,45-мг токсина на 1 л куль-. туральной жидкости, а штамм К$167, содержащий плазмиду рСТ 110 — 1 мг

10 токсина на 1 л культуральной жидкости.

Таким образом, полученный непато-. генный штамм Е. coli К$1672 является

15 перспективным для налаживания .производства очищенного препарата холерного токсина. Препарат холерного токсина необходим для получения химических вакцин, антисывороток и других диагностических препаратов против диарейных заболеваний животных и человека, вызываемых V.cholerae и патогенными Е.coli.