Способ получения мутантов бактерий-продуцентов полисахаридов

 

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МУТАНТОВ БАКТЕРИЙ - ПРОДУЦЕНТОВ ПОЛНСАХАРВДОВ, предусматривающий выращивание бактерий кишечной группы, имеющей неслнзистую морфологию колоний, на питательной среде с последуюо1им отбором мутантов,продуцирующих полисахариды , по слизистой морфологии колоний, отличающийся тем, что, с целью повышения частоты выхода генетически стабильных мутантов, выращивание осуществляют в жидком питательном бульоне, после чего высевают культуру на поверхность питательной среды, содержащей глюкозу в качестве источника углерода, вьщерживают сначала при 43-44°С в течение 24-48 ч, а затем ад при 28-30 С до образования колоний, (Л имеющих слизистую морфологию.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК (5I)4 С 12 > 15/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

AO ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 3603664/28-13 (22) 10.06 82 (46) 07.08.85. Бюл. У 29 (72) Г.Г.Оганесян и Г.P.Ïàãëåâàíÿí (71) Институт микробиологии АН Ар" мянской CCP (53) 579.25(088.8) (56) Narkovitz А. п. ьигЕасе car

bohydrates of procariotic cells, ьд. sutherland. ?. ИЛ. Асад-Press, 1977, р. 415.

Патент США У 4235966, кл. С 12 Р 19/04, опублик. 1980. (54)(57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ?1УТАНТОВ

БАКТЕРИЙ вЂ” ПРОДУЦЕНТОВ ПОЛИСАХАРИДОВ, предусматривающий выращивание бакте„„SU„„ 117 2 А рий кишечной группы, имеющей неслизнстую морфологию колоний, на питательной среде с последующим отбором мутантов,продуцирукицих полисахариды, по слизистой морфологии колоний, отличающийся тем, что, с целью повышения частоты выхода генетически стабильных мутантов, выращивание осуществляют в жидком питательном бульоне, после чего высевают культуру на поверхность питательной среды, содержащей глюкозу в качестве источника углерода, выдерживают сначала при

43-44 С в течение 24-48 ч, а затем при 28-30 С до образования колоний, о имеющих слизистую морфологию.

Таблица 1

Количество

Шт амм ел слизистых вы- кле мутантов, 43,5

Escherichia coli

К-12

20-22 (комнатная) <50

Ингибиру- ется

43,5

30 (50

43,5

37 (оптимальная)

20-22

Не инги0

42 бирует30

37

0 ся

1 1171

Изобретение относится к микробиологии, в частностти к генетике и селекции высокоактивных штаммов— продуцентов полисахаридов.

Цель изобретения — повышение частоты выхода генетически стабильных мутантов.

Способ осуществляют следующим образом.

Бульонную культуру неслиэистого fO родительского ытамма после серийных разведений в физиологическом растворе высевают на поверхность минимальной агаризованной среды, 1-2 дня выдерживают при повышенной темпера- f$ туре, ингибирующей пеление клеток, но не приводящей к их гибели. Затем переносят на температуру ниже оптио мальной на 5-7 С или в комнатную и инкубируют до образования. видимых 20 колоний. Отбор мутантов, продуцирую- щих полисахариды с высоким Е выхода, ведут по слизистой морфологии коло-. ний.

Хотя положительный эффект дости- 25 гается для Е.coli К-12 при повышенных температурах в пределах 43о

46,5 С, увеличение температуры выше о

44 С нерационально, что требует дополнительных затрат энергии, поэтому оптимальным является повышение о температуры на 1-2 С выше максимальной.

Выдерживание культуры при повышенной температуре в течение суток связано с необходимостью проведения контроля эа отсутствием роста колоний в сравнении с ростом при оптимальной температуре. Инкубация мик523 2 роорганизмов в сроки свыше 2 сут приводит к естественному отмиранию клеток, что отражается на выходе мутантов.

Пример 1. Неслизистый штамм

Escherichia coli K-12 выращивается в мясо-пептонном бульоне при о

37 С с аэрацией до достижения экспоненциальной фазы роста, делаются серийные разведения в физиологическом растворе и пробы по О, 1 мл высеваются на поверхность агариэованной минимальной среды следующего состава, г/л: Na, НРО .6; КП РО, 3;

НН,,С1 1; MgSOq 0,013; глюкоза — 5; агар-агар 15. Засеянные чашки ставятся на инкубацию при 43,5 С, полностью подавляющей рост культуры, выдерживаются 24 ч, а затем при комнатной температуре. Через 4-5 сут инкубации на поверхности агара образуются колонии, более 50Х которых обладают слизистой морфологией. Полученные мутанты при культивировании глубинным способом на глюкозо-солевой питательной среде синтезируют в больших количествах кислый гетерополисахарид, состоящий из - -фруктозы

О-галактозы, О-глюкозы и глюкуроновой кислоты в соотношениях 2:2:1:1 соответственно.

Результаты изменения границ повышенной и пониженной температуры инкубации даны в табл. 1

H p и м е р 2. Проводят опыты с неслизистым штаммом Salmonella typhimunium LT-2. Условия опыта аналогичны условиям, описанным в примере 1. Результаты опыта даны в табл.2.

1171523

Та блица 2

Время обКоличество

Инкубация

Инкубация

Деление клеток

Штамм при повышенной разования колоний, сут слизистых мутантов, 7 при пониженной температуре, С температуре, С

Salmonella

typhimunium

LT-2

4-5

50

50

37

Не инги- 20-22 бируется 28-30

42

Составитель В. Голимбет

Редактор Н. Гунько Техред С.Йовжий Корректор В.ГиРнЯк

Заказ 4819/27

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Ингиби- 20-22 руется

28-30

Тираж 525 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Иосква, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

У (0,001

< 0,001 с .0,001 (0,001