Биочип

Устройство относится к диагностике в области медицины, криминалистики и тестирования генетически модифицированных объектов в продуктах. В соответствии с техническим решением, рабочая зона биочипа содержит асимметрично расположенные относительно горизонтальной и/или вертикальной оси рабочей зоны от двух до четырех групп кластеров положительного контроля и, по меньшей мере, одну группу кластеров отрицательного контроля, причем количество кластеров входящих в каждую группу положительного и отрицательного контролей составляет от 1 до 7. Один из кластеров, входящих в каждую из групп положительного контроля, размещен в противоположных углах рабочей зоны, а соотношение общего количества кластеров положительного и отрицательного контролей составляет от 1:1 до 10:1. Рабочая зона биочипа расположена на поверхности твердого носителя или на поверхности гибкого носителя или на поверхности мультислоя, закрепленного на гибком или твердом носителе, или на поверхности твердого носителя снабженного мультислоем, с возможностью формирования гибридизационного объема. В качестве материала зонда, входящего в кластер положительного контроля, служит олигонуклеотид с известной нуклеотидной последовательностью, или гомологичной последовательностью, выбранной из последовательностей генов маркеров, относящихся к выбранному типу диагностики, а материал зонда входящего в кластер отрицательного контроля состоит из олигонуклеотида, частично комплементарного последовательности положительного контроля, или олигонуклеотида, частично комплементарного последовательности одного из олигонуклеотидов-зондов. 11 п. ф-лы, 3 илл., 1 пр.

Техническая область

Полезная модель относится к области диагностики на основе биочипов, содержащих рабочую зону на которой иммобилизованы зонды с олигонуклеотидами или белками, в состав которых входят зонды комплементарные диагностируемым маркерам, а также зонды положительного и отрицательного контролей.

Уровень техники

Известны биочипы, которые используют для диагностики медицинских заболеваний, биочипы для диагностики наличия ГМИ в продуктах и кормах, биочипы для тестирования загрязнения окружающей среды, биочипы для научных исследований и криминалистики. В практике диагностики используют разные типы биочипов. Биочипы с большой плотностью размещения зондов (Rava R.P. et al., 2004) дороги и используются главным образом для научных исследований, поскольку требуют сложного диагностического оборудования при их изготовлении и в процессе съема данных и анализа. Широкое применение находят биочипы у которых в рабочей зоне биочипа размещено от нескольких единиц до нескольких десятков разных типов ДНК зондов (Zeleny R. et al., 2001) или белков. Более простые биочпы используют в небольших лабораториях, в больницах и в тестовых лабораториях. На их поверхности размещено не более двадцати типов зондов. Такие биочипы используют для медицинской диагностики конкретных типов болезней, для определения наличия или отсутствия ГМИ в продуктах (Белецкий И.П. и др., 2005, Мирзабеков А.Д. и др., 2006). Биочипы не большой плотности дешевы и позволяют осуществлять быстрый анализ большого числа биочипов на достаточно простом оборудовании.

Одной из серьезных проблем, возникающих при массовой диагностике с помощью дешевых биочипов является надежность анализа, воспроизводимость результатов и возможность транспортировки и хранения без уменьшения чувствительности и воспроизводимости.

Для контроля качества диагностики, используют способы, связанные с нанесением отдельных тестовых зондов дополнительно к олигонуклеотидам-зондам в каждом кластере биочипа, что позволяет контролировать качество иммобилизации зондов до проведения гибридизации (Kincaid R.H., 2003). Однако этот способ требует больших затрат времени и материалов. Известны способы иммобилизации на поверхности подложки биочипа отдельных дополнительных кластеров с тестовыми зондами, например, кластеров отрицательного контроля (Мирзабеков А.Д. и др., 2006) или одновременно нанесения на биочип кластеров положительного и отрицательного контроля (Белецкий И.П. и др., 2005).

Для более успешной обработки данных анализа на поверхность биочипа вводят дополнительные маркеры, индицирующие одну (Zeleny R. et al., 2001) или две границы рабочей зоны (Мирзабеков А.Д. и др., 2006), что необходимо для работы компьютерных программ по обработке результатов диагностики. Таким образом, совершенствование контроля качества достаточно простых биочипов и совершенствование контроля качества проведения процесса диагностики является актуальной задачей, поскольку известные биочипы ориентированы на тестирование отдельных процессов диагностики.

Наиболее близкими аналогами полезной модели являются биочипы, разработанные для анализа качества пищевых продуктов (Белецкий И.П. и др., 2005, Мирзабеков А.Д. и др., 2006). Общей особенностью известных типов биочипов является наличие на рабочей поверхности дополнительных положительных и/или отрицательных контролей. Недостатком биочипа приведенного в описании (Белецкий И.П. и др., 2005,) является применение большого числа положительных контролей разного типа. Увеличение количества типов положительных контролей, участвующих в реакции ПЦР, требует отработки параметров мультипраймерной асимметричной ПЦР и приводит к снижению эффективности ПЦР за счет увеличения количества шагов реакции. Кроме того, размещение кластеров положительного контроля вдоль одной границы рабочей зоны биочипа, может привести к ошибкам интерпретации результатов, поскольку другие границы рабочей зоны не отмаркированы.

Применяемые для диагностики биочипы могут быть выполнены из разных материалов. Наиболее широко используются прозрачные материалы, выполненные из стекла (Белецкий И.П. и др., 2005, Мирзабеков А.Д. и др., 2006) или полимеров ((Шляпников Ю.М. и др. 2007, Зарытова В.Ф. и др., 2004). В некоторых случаях на биочип наносят идентификатор, характеризующий параметры биочипа. В качестве

идентификатора широко используют штрих-код (Zeleny R. et al., 2001). При отсутствии тестовых индикаторов границ биочипа возникает возможность осуществления неправильной оценки результатов диагностики за счет неправильной установки биочипа в сканирующее устройство или за счет неправильного выбора размеров изображения при работе компьютерных программ.

Возможны три варианта неправильной установки биочипа, размещенного на прозрачном носителе. Неправильная установка возможна как за счет горизонтального разворота биочипа на 180 градусов при сохранении положения рабочей поверхности, в котором лицевая поверхность направлена вверх. Возможен переворот биочипа и установка его лицевой поверхности вниз. В третьем варианте возможен одновременный горизонтальный и вертикальный повороты относительно правильного положения. В третьем варианте, наличие индикаторов, расположенных вдоль одной из границ рабочей зоны, не гарантирует от ошибок интерпретации, поскольку индикаторы, расположенные, например, с левой стороны изображения не меняют своего положения, в то время как положение остальных кластеров изменяется.

Известен биочип (Мирзабеков А.Д. и др., 2006), в котором наряду с кластерами отрицательного контроля используют флуоресцентные маркеры для контроля положения биочипа, размещенные вдоль двух сторон рабочей зоны. К недостатку такой конструкции биочипа, можно отнести уменьшение рабочей поверхности биочипа за счет размещения дополнительных флуоресцентных маркеров в углах рабочей зоны и отсутствие положительных контролей и, следовательно, снижение функций контроля качества биочипа. Кроме того, маркеры выполнены из другого материала, чем олигонуклеотидный зонд и поэтому требуется смена печатающей головки при печати зондов на поверхности биочипа, например, капельным способом.

Техническая задача состоит в том, чтобы создать конструкцию нового биочипа, обладающего большей достоверностью и воспроизводимостью получаемых результатов проводимых в области медицины, криминалистики или при тестировании качества пищевых продуктов.

Другой технической задачей является снижение затрат на производство биочипов.

Указанные технические задачи решаются за счет разработки новой конструкцией биочипа, в котором положительные контроли выполняют две функции, а) функцию контроля процесса производства биочипа и его использования

в процессе диагностики, б) функцию индикации границ рабочей зоны для контроля за правильностью установки биочипа в сканирующее устройство.

За счет выбора материала кластеров положительного и отрицательного контроля техническое решение, раскрытое в полезной модели, позволяет осуществить контроль за достоверностью диагностики включающий, но не ограничивающий: проверку качества используемых биочипов, проверку качества реактивов для диагностики, проверку правильности выбора режимов проведения реакции ПЦР и гибридизации, проверку правильности проведения промывок и сушки биочипов. Одновременно уменьшаются ошибки, возникающие при компьютерной обработке данных за счет контроля правильности установки биочипа в сканирующее устройство. Снижение затрат осуществляется за счет выбора материала из которого формируют кластеры положительного контроля, который не требует перенастройки оборудования при печати кластеров на поверхность биочипа.

Перечень фигур

Фиг.1. Размещение положительных (Q+) и отрицательного (Q-) кластеров. Где: а) вариант с минимальным количеством положительных и отрицательных кластеров, б), в), г) варианты размещения групп положительных кластеров представленных в виде уголковых и линейных структур.

Фиг.2. Фронтальная проекция биочипа, снабженная покрывным листом.

Фиг.3. Изометрическая проекция биочипа, снабженная покрывным листом.

Описание

Предлагаемая полезная модель устраняет недостатки известных конструкций и увеличивает надежность интерпретации полученных результатов диагностики.

Биологический микрочип для диагностики заболеваний, для криминалистики и для определения генетически модифицированных объектов в продуктах, содержит планарный элемент, на поверхности рабочей зоны которого в форме кластеров иммобилизованы зонды комплементарные нуклеотидным последовательностям маркеров диагностики и последовательностям положительного и отрицательного контроля. При этом рабочая зона содержит от двух до четырех групп кластеров положительного контроля и, по меньшей мере, одну группу кластеров отрицательного контроля, причем расположение кластеров положительного контроля, размещенных в двух частях рабочей зоны биочипа относительно горизонтальной и/или вертикальной оси биочипа, асимметрично друг относительно друга. Кроме того, количество кластеров входящих в каждую группу положительного и отрицательного контролей составляет от 1 до 7. При этом один

из кластеров, входящий в группу положительного контроля, размещен в углу рабочей зоны, а соотношение общего количества кластеров положительного и отрицательного контролей составляет от 1:1 до 10:1. Рабочая зона биочипа расположена на поверхности твердого носителя или на поверхности гибкого носителя или на поверхности мультислоя, закрепленного на гибком или твердом носителе, или на поверхности твердого носителя снабженного мультислоем, с помощью которого сформирован, по меньшей мере, один гибридизационный объем. В качестве материала зонда, входящего в кластер положительного контроля, служит олигонуклеотид с нуклеотидной последовательностью, или гомологичной последовательностью, выбранной из последовательностей генов маркеров, относящихся к выбранному типу диагностики. В качестве материала зонда, входящего в кластер отрицательного контроля, служит олигонуклеотид, частично комплементарный последовательности положительного контроля, или олигонуклеотид, частично комплементарный последовательности одного из олигонуклеотидов-зондов.

На фиг.1а приведена структурная схема, которая содержит минимальное количество групп кластеров. В этом варианте биочипа два положительных контроля (Q+) размещаются в углах рабочей зоны (1) биочипа по диагонали прямоугольного или квадратного поля и занимают асимметричное положение относительно горизонтальной (2) и/или вертикальной оси (3) рабочей зоны биочипа. Отрицательный контроль (Q-), размещен вдоль границы рабочей зоны и расположен рядом с положительным контролем.

Для формирования асимметричного изображения для размещения положительных контролей может использоваться комбинация из нескольких групп положительных контролей. На фиг.16 приведен вариант структурной схемы размещения положительных (Q+) и отрицательных (Q-) кластеров в варианте, в котором группы положительных кластеров размещают таким образом, что они образуют уголковую структуру, состоящую из трех кластеров с одной стороны рабочей зоны, и линейную структуру с другой стороны рабочей зоны, образуя асимметрию в положении положительных кластеров друг относительно друга. Уголковые структуры могут быть выполнены в виде равносторонних, как это показано на фиг.2б или неравносторонних уголковых геометрических элементов, при этом общее количество кластеров, составляющих уголковый элемент, выбирают от 3 до 11. Предпочтительно от 3 до 7.

Линейные структуры могут быть выполнены в виде столбца или строки из кластеров, размещенных вдоль границ рабочей зоны биочипа. При этом, по меньшей мере, один из кластеров (4, 5, 6), входящие в линейные или уголковые структуры, размещен в выбранном угле рабочей зоны биочипа, в котором размещена линейная или уголковая структура. В варианте представленном на фиг.1в при размещении групп положительного контроля формируют асимметричное изображение с помощью двух групп кластеров линейной структуры, размещенных в противоположных углах рабочей зоны и третьего кластера, расположенного в третьем угле рабочей зоны. Вариант размещения четырех групп положительных кластеров, размещенных в четырех углах рабочей зоны, приведен на фиг.1г.

Асимметрия изображения формируется за счет разного количества кластеров, входящих в разные группы. Приведенные варианты включают, но не ограничивают других вариантов размещения положительных кластеров асимметрично расположенных относительно горизонтальной и/или вертикальной оси биочипа. Положительные кластеры выполняют дополнительную функцию индикаторов, и позволяют идентифицировать местоположение рабочей зоны на биочипе при программной обработке результатов, после сканирования результатов диагностики.

При этом, по меньшей мере, один отрицательный контроль размещен вдоль границы рабочей зоны и расположен рядом с положительным контролем, что включает, но не ограничивает других вариантов размещения отрицательных контролей на рабочей зоне биочипа.

В рассматриваемой полезной модели в качестве материала зонда входящего в кластер положительного контроля использован олигонуклеотид с известной нуклеотидной последовательностью, или гомологичной последовательностью, выбранной из последовательностей генов маркеров, относящихся к выбранному типу диагностики.

В качестве материала зонда формирующего кластер отрицательного контроля выбран олигонуклеотид, который частично комплементарен последовательности положительного контроля, или олигонуклеотид, который частично комплементарен последовательности одного из олигонуклеотидов-зондов. В последовательности олигонуклеотида иммобилизованного на поверхности рабочей зоны, служащего в качестве отрицательного контроля, количество и положение нуклеотидов, несоответствующих последовательности ДНК положительного контроля, подбирают таким образом, чтобы этот дифференцирующий олигонуклеотид был способен

образовывать и сохранять несовершенный дуплекс с одно-цепочечной ДНК положительного контроля при несоблюдении условий гибридизации и отмывки, а именно при проведении гибридизации и отмывки в условиях более мягких по сравнению с оптимальными.

Биочип может быть выполнен из твердого, гибкого или многослойного материала, представляющего, например, комбинацию твердого планарного носителя с одним или несколькими гибкими слоями, составляющими мультислой.

В качестве материала твердой основы биочипа используют полимеры, металлы, керамику, стекло, слюду или их комбинации. Для создания недорогих биочипов предпочтительно использовать стекло и полимеры. Полимеры выбирают из группы, состоящей из полиметилметакрилата, полибутилметакрилата, поливинилхлорида, поликарбоната, сополимеров метилметакрилата и/или сополимеров бутилметакрилата с другими мономерами, такими как стирол, акрилонитрил и др. Толщина несущего элемента предпочтительно должна выбираться одинаковой с толщиной используемых слайдов и лежать в пределах от 0,5 мм до 5 мм.

Материалов полимеров может быть прозрачным, матовым, белым, черным или цветным. Для измерения результатов диагностики в режиме пропускания материал биочипа должен обладать величиной пропускания света не менее 80-90%. При измерении отраженного, например, колориметрического сигнала, материал биочипа выбирают с белой отражающей поверхностью. Для измерения сигналов в режиме флуоресценции необходимо, чтобы материал слайда или внешней поверхности мультислоя обладал минимальной собственной флуоресценцией.

В зависимости от способа регистрации флуоресценции материал биочипа может быть прозрачным, выполненным из стекла или прозрачного пластика, например, полиметилметакрилата или выполнен в виде непрозрачного материала, например, черного цвета обладающего минимальной отражающей способностью, выполненного, например, из полихлорвинила.

В качестве материала гибкого слоя используют полимеры и/или металлы толщина гибкого слоя составляет от 0,05 до 1 мм. Гибкий слой, входящий в состав мультислоя выполняют из материалов, входящих в группу, состоящую из: i) непрозрачных материалов, ii) светопроницаемых материалов, iii) светоотражающих материалов, iv) светопоглощающих материалов.

В состав мультислоя могут входить: а) гибкие слои, снабженные одним клеящим слоем, б) гибкие слои, снабженные двумя клеящими слоями и нанесенными на верхнюю и нижнюю поверхности гибкого слоя, в) гибкие слои, не

снабженные клеящим слоем, г) комбинации слоев входящих в пункты а), б), в). Гибкие слои, формирующие мультислой, размещены друг над другом и соединены таким образом, что одна из поверхностей верхнего или нижнего мультислоя содержит самоклеящий слой, который приклеивают к верхней и/или нижней поверхности несущего элемента и к поверхности слайдов путем создания давления. Адгезивный или клеевой слой должен создавать прочную связь между поверхностью слайдов, поверхностью несущего элемента и мультислоями. Эта связь должна быть стабильной и не должна нарушаться при изменении температуры внешней окружающей среды в диапазоне от -10 до 60°С. Адгезионный слой должен сохранять свои клеящие параметры в условиях действия реагентов, используемых для промывок поверхности слайдов или при формировании модифицирующего слоя на поверхности слайдов, или реагентов, участвующих в формировании раствора для гибридизации.

В процессе изучения свойств полимерных материалов с нанесенным на их поверхность клеящим слоем, было обнаружено, что гибкие полимерные материалы, с нанесенными на них клеящими слоями (выполненные в виде самоклеящихся пленок), не изменяют своих физико-химических параметров в условиях изменяющейся температуры в диапазоне от -10°С до +60°С и в среде буферов для гибридизации. Это позволяет использовать самоклеящие пленки для изготовления множества вариантов недорогих мультичипов, поскольку исключается этап нанесения клеевого слоя.

Биочип, выполненный из твердого, гибкого или многослойного материала, может быть дополнительно снабжен модифицирующим слоем для более прочной иммобилизации олигонуклотидов-зондов и олигонуклеотидов положительного и отрицательного контролей в рабочей зоне биочипа.

Поверхность твердой или гибкой основы биочипа, выполненная из полимеров, стекла, металлов и композитов может быть модифицирована слоем аминосиланов (Lefkowitz S.M. et al., 2005). Поверхность полимерных биочипов может быть модифицирована растворами реагентов не создающих дополнительных слоев (Шляпников Ю.М. и др. 2007). Известно, что зонды можно наносить на рабочую поверхность биочипа без модификации поверхности (Зарытова В.Ф. и др., 2004) или полимеризовать зонды в каплях агарозного геля (Мирзабеков А.Д. и др., 2003). Возможно модифицировать всю поверхность биочипа или модифицировать только поверхность рабочей зоны, расположенной внутри гибридизационной зоны.

Известны варианты биочипов, на поверхности которых создают гибридизационные объемы с помощью решеток (Harvey M.A. et al., 2005), или за счет создания герметичных гибридизационных объемов с жидкостными вводами и выводами (Yuen P.К., 2002). Однако реализация данных технических решений увеличивает стоимость биочипов. В более простом варианте биочип выполняют в виде комбинации твердого носителя и гибкого мультислоя, снабженного клеящим слоем. При этом в материале гибкого слоя выполняют одно или несколько сквозных отверстий, границы которых совпадают или с границей общей рабочей зоны биочипа или с границами отдельных рабочих зон относящихся к отдельным кластерам или группе кластеров. Гибридизационный объем формируется между рабочей поверхностью твердого носителя биочипа и стенками отверстия в гибком мультислое (Lee J. et al., 2005; Yin Li-Te et al., 2005).

В отличие от известных вариантов биочипов, выполненных на твердой основе (Zeleny R. et al., 2001) или выполненных на основе многослойных биочипов с гибридизационными объемами (Lee J. et al., 2005), для повышения воспроизводимости результатов диагностики, в данной полезной модели предлагается вариант биочипа, согласно которому, дополнительно к асимметричному размещению положительных кластеров на рабочей зоне биочипа, на вспомогательной поверхности биочипа закреплен покровный лист, к одному из угла которого приклеплен ярлык. Ярлык обеспечивает возможность частичного или полного снятия покровного листа с поверхности биочипа на разных этапах диагностики.

На фиг.2а приведен фронтальный вид биочипа (7), снабженного покровным листом (8) к которому приклеен ярлык (9). Покровный лист приклеен к поверхности вспомогательной зоны (10) биочипа, размещенной по периметру рабочей зоны (1). Применение покровного листа обеспечивает повышение воспроизводимости результатов диагностики, поскольку покровный лист защищает рабочую зону от влияния света и от воздействия влажности при перевозке и хранении биочипа, а также не дает высыхать гибридизационной смеси в процессе гибридизации.

На фиг.2б приведено аксонометрическое изображение одного из вариантов, который включает, но не ограничивает других решений по конструкции биочипа (7) выполненного на основе твердого несущего элемента (11) с гибким мультислоем (12), закрепленным на лицевой поверхности биочипа. В гибком мультислое выполнено сквозное отверстие (13) формирующее границы рабочей зоны биочипа. Покровный лист (8), снабженный ярлыком (9), выполнен с возможностью

приклеивания и отсоединения его клеевого слоя от поверхности биочипа. Для формирования клеевого слоя используется двухсторонняя клеящая лента (14).

Устройство работает следующим образом. В исходном состоянии покровный лист приклеен к вспомогательной поверхности биочипа и защищает нанесенные кластеры (15) на поверхности рабочей зоны от влияния внешней среды. Перед проведением гибридизации часть покровного листа (8) с помощью ярлыка (9) отсоединяют от верхней поверхности биочипа и открывают доступ к гибридизационному объему (16). Затем наносят гибридизационный раствор на рабочую зону (1) биочипа и снова закрывают гибридизационный объем, приклеивая покровный лист (8). После проведения гибридизации покровный лист (8) снимают с помощью ярлыка (9) со всей поверхности биочипа. Поверхность биочипа промывают и высушивают для сканирования результатов диагностики. Установка покровного листа устраняет неконтролируемое загрязнение и формирование ложных результатов в процессе диагностики.

Для повышения достоверности результатов на вспомогательной зоне биочипа располагают один или несколько идентификаторов (17), которые содержат информацию о типе биочипа, дате его выпуска и о других параметрах идентифицирующих конкретный биочип с проводимой диагностикой. Данные идентификатора используют в программах обработки и хранения результатов диагностики. В варианте, когда на поверхности биочипа размещен один идентификатор (17), его предпочтительно размещают рядом с одним из торцевых краев биочипа, предпочтительно в том месте, которое оператор использует для удерживания биочипа при его установке в сканирующее устройство. В том случае, когда на поверхности биочипа формируют более одной рабочей зоны, разделенных друг от друга решетками, выполненными, например, из материала мультислоя, то идентификаторы могут быть расположены не только с одной торцевой стороны биочипа как это показано на фиг.2а, но и с нескольких сторон, включая вспомогательную зону, например на боковых поверхностях биочипа. Идентификаторы могут быть выполнены, например, в виде штрих-кода или в виде наклейки из магнитного материала.

Идентификатор (17), может быть выполнен в виде этикетки с клеящим слоем. В другом варианте идентификатор может быть нанесен в виде графического изображения на поверхности мультислоя перед процессом сборки многослойной конструкции биочипа. Дополнительно к общему идентификатору на поверхность гибкого слоя на вспомогательной поверхности могут быть графически отображены

дополнительные идентификаторы, выполненные в виде цифровых (18) и/или буквенных (19) изображений.

В другом варианте реализации биочипа мультислой может содержать отражающий слой, который повышает эффективность сканирования зондов с флуоресцентными метками, повышая отраженный сигнал флуоресценции до четырех раз. Известны биочипы, представляющие многослойную конструкцию, в состав которой входит твердая основа, на которой размещены отражающий и прозрачные слои (Weisbuch С. et al., 2004). В изобретении (Lefkowitz S.M., 2003) биочипы формируют на гибком мультислое, расположенном на лицевой поверхности биочипа, в котором отражающий слой формируют с помощью вакуумного или плазменного напыления.

Известны биочипы в которых отражающий слой может быть нанесен с обратной стороны прозрачного носителя биочипа (Matsushita Т. et al., 2006). В предлагаемом варианте биочипа, в качестве отражающего или световозвращающего слоя используют самоклеящую пленку с отражающим или световозвращающим покрытием. Эту пленку приклеивают к твердой несущей поверхности, и на ее поверхность приклеивают второй мультислой с помощью которого формируют, по меньшей мере, один гибридизационный объем, за счет изготовления соответствующих сквозных отверстий в во втором мультислое, совпадающих с границами рабочих зон биочипа. Таким образом, комбинация асимметричного размещения положительных контролей в углах рабочей зоны биочипа с возможностью создания гибридизационного объема с помощью мультислоя и с возможностью защиты рабочей зоны от воздействия окружающей среды и защиты гибридизационного объема за счет крепления покровного листа, обеспечивает синергический эффект по повышению большей достоверности и воспроизводимости результатов диагностики проводимой в области медицины, криминалистики или при тестировании качества пищевых продуктов.

Пример

Выбор материала и синтез олигонуклеотидов-праймеров.

Выбор состава материала для олигонуклеотидов-праймеров выбирают с учетом требований высокой специфичности к консервативным участкам исследуемых генов, что позволяет проводить избирательное выделение фрагментов ДНК и последующую амплификацию совместно с олигонуклеотидами-праймерами при помощи ПЦР непосредственно из биологических образцов.

Олигонуклеотиды синтезируют на автоматическом синтезаторе (например, модель "Gene Assembler" фирмы Pharmacia) стандартным амидофосфитным методом. Каждая пара олигонуклеотидов для ПЦР, специфичных к маркеру диагностики, состоит из одного немеченного (не содержащего каких-либо меток, необходимых для последующего анализа и интерпретации результатов) специфического олигонуклеотида-праймера и меченого (содержащего одну или несколько меток, необходимых для последующего анализа и интерпретации результатов) специфического олигонуклеотида.

Метки, модифицирующие праймеры по 5'-концу, выбирают из группы, состоящей из: каталитической, лигандной, флуоресцентной и радиоактивной, которую вводят химическими методами или энзиматически. В качестве каталитических меток используют гемин, цианкобаламин или флавин (Белецкий И.П. и др., 2005). В качестве лигандных меток используют биотин, диоксигенин или динитробензол. В качестве флуоресцентных меток используют Су3, Су5, Су7, FAM, TAMRA, R6G, R110, ROX или JOE. Приведенные перечни меток включают, но не ограничивают других вариантов меток, которые можно использовать для детектирования сигнала.

Олигонуклеотиды синтезируют на автоматическом синтезаторе (например, модель "Gene Assembler" фирмы Pharmacia) стандартным амидофосфитным методом. Олигонуклеотиды, входящие в состав зондов, содержат 5'- или 3'-концевую группу, обеспечивающую их иммобилизацию на поверхности чипа, например, 5'-концевую фосфатную группу, которую вводят при помощи химического фосфорилирования в процессе синтеза.

Промышленная применимость

Новое техническое решение позволяет осуществить процесс контроля диагностики включающий, но не ограничивающий: проверку качества используемых биочипов, проверку качества реактивов для диагностики, проверку правильности выбора режимов проведения реакции ПЦР и гибридизации, проверку правильности проведения промывок и сушки биочипов, одновременно с уменьшением ошибок, возникающих при компьютерной обработке данных за счет неправильной установки биочипа в сканирующее устройство. Сокращение номенклатуры материалов, из которых выполнены кластеры положительного контроля, и их использование в качестве индикаторов границ рабочей зоны биочипа, позволяет сократить расходы при изготовлении биочипов и расходы, связанные с анализом данных диагностики.

Литература

1. Rava R.P. et al. Methods for concurrently processing multiple biological chip assays. US Patent 6,720,149 (April 13, 2004).

2. Zeleny R. et al. Automatic imaging and analysis of microarray biochips. US Patent 6,215,894 (April 10, 2001).

3. Белецкий И.П. и др. Набор праймеров для детекции и/или идентификации трансгенных последовательностей ДНК в растительном материале и его содержащих продуктах (варианты), праймер (варианты), пара праймеров (варианты), способ детекции и/или идентификации с их использованием (варианты) и устройство для осуществления способа. Патент RU 2265668 (2005.12.10).

4. Мирзабеков А.Д. и др. Способ идентификации трансгенных последовательностей ДНК в растительном материале и продуктах на его основе, набор олигонуклеотидов и биочип для осуществления этого способа. Патент RU 2270254 (2006.02.20).

5. Kincaid R.H. Apparatus and methods of detecting features on a microarray. US Patent Applic. 20030186310 (October 2, 2003).

6. Шляпников Ю.М. и др. Способ получения ДНК-чипов (варианты) Заявка на патент RU 2005125776 (2007.02.20).

7. Зарытова В.Ф. и др. Способ получения ДНК-чипов. Патент RU 2236467 (2004.09.20).

8. Lefkowitz S.M. et al. Chemical arrays. US Patent 6,841,663 (January 11, 2005).

9. Harvey M.A. et al. Device for preparing multiple assay samples using multiple array surfaces. US Patent Applic. 20050135974 (June 23, 2005).

10. Yuen P.К. Well frame including connectors for biological fluids. US Patent Applic. 20020168624 (November 14, 2002).

11. Lee J. et al. Patch for microarray reaction chamber having adhesive means support and two or more adhesive materials. US Patent Applic. 20050136459 (June 23, 2005).

12. Yin Li-Te et al. Biochip containing reaction wells and method for producing same and use thereof. US Patent Applic. 20050106607 (May 19, 2005).

13. Weisbuch С. et al. Biochip type device. US Patent Applic. 20040222480 (November 11, 2004).

14. Matsushita Т. et al. Component, apparatus, and method for analyzing molecules. US Patent 6,999,166 (February 14, 2006).

15. Мирзабеков А.Д. и др. Способ полимеризационной иммобилизации биологических макромолекул и композиция для его осуществления. Патент RU 2216547 (2003.11.20).

1. Биологический микрочип для диагностики заболеваний, криминалистики и тестирования генетически модифицированных объектов в продуктах, содержащий твердый носитель, на рабочей зоне которого в форме кластеров иммобилизованы олигонуклеотидные зонды, комплементарные нуклеотидным последовательностям маркеров диагностики и последовательностям положительного и отрицательного контроля, отличающийся тем, что рабочая зона содержит асимметрично расположенные относительно горизонтальной и/или вертикальной оси рабочей зоны от двух до четырех групп кластеров положительного контроля и, по меньшей мере, одну группу кластеров отрицательного контроля, причем количество кластеров, входящих в каждую группу положительного и отрицательного контролей, составляет от 1 до 7, при этом один из кластеров, входящих в каждую из групп положительного контроля, размещен в противоположных углах рабочей зоны, а соотношение общего количества кластеров положительного и отрицательного контролей составляет от 1:1 до 10:1, где рабочая зона биочипа расположена на поверхности твердого носителя или на поверхности гибкого носителя или на поверхности мультислоя, закрепленного на гибком или твердом носителе, или на поверхности твердого носителя снабженного мультислоем, с возможностью формирования гибридизационного объема, причем в качестве материала зонда, входящего в кластер положительного контроля, служит олигонуклеотид с известной нуклеотидной последовательностью, или гомологичной последовательностью, выбранной из последовательностей генов маркеров, относящихся к выбранному типу диагностики, а материал зонда входящего в кластер отрицательного контроля состоит из олигонуклеотида, частично комплементарного последовательности положительного контроля, или олигонуклеотида, частично комплементарного последовательности одного из олигонуклеотидов-зондов.

2. Биочип по п.1, отличающийся тем, что на лицевой поверхности несущего элемента дополнительно установлен покрывной лист, снабженный по периметру клеящим слоем и ярлыком, с возможностью присоединения или отсоединения части или всего покрывного листа от вспомогательной зоны несущего элемента.

3. Биочип по п.1, отличающийся тем, что группы положительных кластеров выполнены в форме уголковой или линейной структур.

4. Биочип по п.3, отличающийся тем, что уголковые структуры выполнены в виде равносторонних или неравносторонних уголковых геометрических элементов.

5. Биочип по п.1, отличающийся тем, что в качестве твердой основы биочипа используют полимеры, металлы, керамику, стекло, слюду или их комбинации.

6. Биочип по п.5, отличающийся тем, что полимеры выбирают из группы, состоящей из полиметилметакрилата, полибутилметакрилата, поливинилхлорида, поликарбоната, сополимеров метилметакрилата и/или сополимеров бутилметакрилата с другими мономерами, такими как стирол, акрилонитрил.

7. Биочип по п.5, отличающийся тем, что толщина твердой основы лежит в пределах от 0,5 мм до 5 мм.

8. Биочип по п.1, отличающийся тем, что в качестве гибкого слоя используют полимеры и/или металлы.

9. Биочип по п.1, отличающийся тем, что гибкий слой выполнен из полимеров и/или металлов, причем толщина гибкого слоя составляет от 0,05 до 1 мм.

10. Биочип по п.5, отличающийся тем, что твердую основу выполняют из непрозрачных или светопроницаемых материалов.

11. Биочип по п.9, отличающийся тем, что гибкий слой выполняют из материалов, входящих в группу, состоящую из: i) непрозрачных материалов, ii) светопроницаемых материалов, iii) светоотражающих материалов, iv) светопоглощающих материалов.