Тест-система иммуноферментная для полуколичественного определения аллергенспецифических ige и igg-антител для диагностики микозов (ифтс-мико-ige-igg-at)

Тест - система иммуноферментная для полуколичественного определения аллергенспецифических IgE и IgG - антител для диагностики микозов (ИФТС-мико-IgE-IgG-AT) Полезная модель используется в медицинской лабораторной диагностике. Поставленная задача осуществляется посредством предлагаемой тест -системы ИФТС-мико-IgE-IgG-AT, разработанной с помощью твердофазного сэндвич-метода в 96-луночном стрипированном планшете с использованием моноклональных антител, входящих в состав пероксидазных конъюгатов, МКАТ-анти-IgE и МКАТ-анти-IgG. Метод основан на сочетании иммунологических реакций на первом этапе между грибковыми аллергенами, иммобилизованными на полистироловой поверхности лунок планшета, и специфическими к этим аллергенам IgE - и IgG - антителами из образца сыворотки с образованием на твердой фазе иммунологических комплексов АГ-AT ₁. На втором этапе между комплексами АГ-АТ ₁ и конъюгатами МКАТ-анти-IgE и МКАТ-анти-IgG с образованием иммунологических комплексов AT-AT₁-AT ₂, меченных ферментом пероксидазой. Последующая ферментативная цветная реакция происходит между пероксидазой и субстратом. Продукты расщепления реакции превращают молекулы хромогена - ТМБ в окрашенное производное, количество которого пропорционально ферментативной активности. Степень окрашивания учитывается фотометрически при 450 нм. Содержание аллергенспецифических IgE-IgG-антител в исследуемых образцах выражается в классах (1-4), соответствующих низкой, средней, умеренно высокой и высокой концентрации IgE и IgG. Полезная модель представляет собой комплект, в состав которого входит набор реагентов, включающий полистироловые планшеты с иммобилизованными аллергенами, референс - сыворотки, промывающий раствор, хромоген, субстрат, стоп - реагент и инструкцию по применению, упакованных в одной коробке.

Полезная модель относится к медицине, а именно, к лабораторной диагностике.

Проблема диагностики и лечения микозов приобретает особую актуальность в связи со значительной распространенностью грибковых заболеваний, общее количество которых за последнее десятилетие выросло более, чем в 2 раза.

Одной из глобальных причин роста микозов считается ухудшение экологических условий на планете, способствующих изменению микроэкологии и иммунореактивности организма.

К настоящему времени накоплено достаточное количество фактов, доказывающих способность грибковых антигенов и различных компонентов их клеточных стенок вызывать различные типы аллергических реакций (I-IV типы), как немедленных IgE-зависимых, так и замедленных - клеточно-опосредованных реакций - IgG-зависимых с участием нескольких иммунных механизмов в формировании этих реакций (Новиков П.Д. Грибковая аллергия / Иммунопатология. Аллергология. Инфектология. - 2004. - №1. - С.37-42; Сергеев Ю.В. Онихомикозы. - М.: ГЭОТАР, 1988. - 256 с.; Mari A. Sensiti-iation to fungi: Epidemiology, comparative skin tests and IgE reactivity of fungal extracts / Clin. Exp. Allergy. - 2003. - v.33, №10. - P.1429-1438).

Очень часто микотическая аллергия сочетается с сенсибилизацией к бытовым, пищевым, пыльцевым аллергенам, что значительно затрудняет диагностику. Серьезную клиническую проблему представляет оценка значимости грибковой сенсибилизации в развитии микозов. Это связано с тем, что

реально человек контактирует примерно со 100 видами грибов, споры которых находятся в атмосферном воздухе, в составе домашней и рабочей пыли, заплесневелых пищевых продуктах и многих других объектах, и из-за их многообразия трудно установить преобладающий вид грибов (Паттерсон Р. Аллергические болезни: диагностика и лечение - М.: ГЭОТАР, 2000. - 768 с).

Клиническая картина микотических заболеваний очень разнообразна, поэтому важная роль принадлежит специфическим методам диагностики. Наиболее предпочтительными и информативными являются методы «in vitro» иммуноферментные и радиоиммунные (РИА).Эти методы обладают высокой специфичностью, чувствительностью и лишены каких-либо ограничений, они позволяют выявить биологически высокоактивные аллергенспецифические антитела, вырабатывающиеся в организме в процессе сенсибилизации (Нго Т.Т. Иммуноферментный анализ. - М.: Мир, 1988. - 446 с.; Чард Т. Радиоиммунологические методы. - М.: Мир, 1981. - 248 с.; Тотолян А.А. Современные подходы к диагностике иммунологических состояний / Мед. Иммунология. - 1999. -T.1, №1-2. - С.75-108).

При использовании этих методов следует учитывать возможную роль различных иммунологических механизмов в развитии аллергических реакций и то, что для диагностики необходимо применять несколько методов, позволяющих оценить участие всех четырех типов сенсибилизации. Следовательно, для обнаружения микотической сенсибилизации реагинового и клеточно-опосредованного типов аллергических реакций первостепенное значение имеет определение специфических IgE- и IgG-антител к грибковым аллергенам.

Близкие по техническому решению зарубежные тест - системы для определения специфических IgE-антител и IgG-антител выпускаются в пробирочном и микропланшетном форматах с комплектом базовых реагентов (конъюгата, калибраторов). Вместе с тем, аллергодиски и аллергены, иммобилизованные на твердофазном носителе (пробирки или стрипы) заказываются дополнительно из предлагаемого перечня аллергенов (до 700 видов) -

Dr. Fooke, Laboratorien GmbH [дистрибьютер фирмы Dr. Fooke, Laboratorien GmbH (Германия) - ЗАО «БиоХимМак Диагностика», г. Москва.] Однако, в указанных тест - системах:

- Отсутствует единый комплект тест - системы для диагностики микозов, включающий все иммунореагенты для выявления специфических IgE- и IgG-антител к грибковым аллергенам;

- Исследование длительно, наборы реагентов дорогостоящие, в 10-15 раз превышающие стоимость отечественной тест - системы;

- Необходимо специальное дорогостоящее оборудование.

Поставлена задача диагностики микотических заболеваний единым комплектом высокоактивных специфических реагентов, сокращения сроков исследования, использования не дорогостоящего оборудования.

Поставленная задача достигается иммуноферментной тест-системой (ИФТС) для полуколичественного определения специфических IgE-IgG-антител к грибковым аллергенам (ИФТС-мико-IgE-IgG-AT) с помощью твердофазного сэндвич-метода в 96-луночном стрипированном планшете с использованием моноклональных антител, входящих в состав пероксидазных конъюгатов, МКАТ-анти-IgE- и МКАТ-анти-IgG. Метод основан на сочетании иммунологических реакций на первом этапе между грибковыми аллергенами, иммобилизованными на полистироловой поверхности лунок планшета, и специфическими к этим аллергенам IgE- и IgG-антителами из образца сыворотки с образованием на твердой фазе иммунологических комплексов АГ-АТ ₁. На втором этапе - между комплексами АГ-АТ ₁ и конъюгатами МКАТ - анти - IgE и МКАТ-анти-IgG с образованием иммунологических комплексов AT-AT₁-AT ₂, меченных ферментом пероксидазой. Последующая ферментативная цветная реакция происходит между пероксидазой и субстратом. Продукты расщепления реакции превращают молекулы хромогена - ТМБ в окрашенное производное, количество которого пропорционально ферментативной активности. Степень окрашивания учитывается фотометрически

при 450 нм. Содержание аллергенспецифических IgE-IgG-антител в исследуемых образцах выражается в классах (1-4), соответствующих низкой, средней, умеренно высокой и высокой концентрации IgE и IgG.

Предлагаемая полезная модель представляет собой комплект, в состав которого входят следующие реагенты, упакованные в одной коробке:

Реагент 1 (P1) - планшеты полистироловые 96-луночные стрипированные с вертикальными рядами из прозрачного полимерного материала (кат. №46460, фирма Nunc, Дания или кат. №95029100, фирма Labsistems, Финляндия), в которых лунки первого и второго рядов сорбированы аллергеном из пыльцы амброзии (А) стандартизированном по содержанию азота белка (производство ГП «Аллерген»), с концентрацией 6±1 мкг/мл - референс - стрипы; лунки с 3 по 12 ряд сорбированы грибковыми аллергенами десяти видов с концентрацией 5±1 мкг/мл, (производство «Sevapharma»,Чехия), запаянные в пакет из полиэтилена, готовы к использованию - P1 - 2 шт.

Реагент 2Е (Р2Е) - человеческие референс - сыворотки с различным содержанием специфических IgE-антител к аллергену (А). Концентрация IgE-антител 4 уровней соответствует 4 классам (условные единицы): P2E₁ (0,35-1,0) ^-, Р2Е₂ (1,0-3,5), Р2Е ₃ (3,5-17,5), Р2Е₄ (17,5-50,0) КЕ/л IgE, опалесцирующие жидкости светло-желтого цвета (ЦНИИРИ, ООО «Полигност», Россия, ЭПР №896-99, ФСП 42-0190-0593-00), стандартизованы относительно Второго Международного Стандартного препарата ВОЗ для IgE человека - 2^nd JRP, 75/502, готовы к использованию, Р2Е - 4 фл. (по 0,06 мл).

Реагент 2G (P2G) - человеческие референс - сыворотки с различным содержанием специфических IgG-антител к аллергену (А). Концентрация IgG-антител 4 уровней соответствует 4 классам (условные единицы): P2G ₁ (0,8-2,0), Р2С₂ (2,0-5,0), P2G ₃ (5,0-20,0), P2G₄ (20,0-44,0) мкг/мл IgG, опалесцирующие жидкости светло-желтого цвета, стандартизованы относительно

препарата WHO 67/97, готовы к использованию, P2G - 4 фл. (по 0,06 мл).

Реагент 3 (Р3) - отрицательная контрольная сыворотка (ОК), не содержащая А - специфических IgE-IgG-антител, опалесцирующая жидкость светло-желтого цвета, готова к использованию, Р3-1 фл (0,1 мл).

Реагент 4Е (Р4Е) - положительная контрольная сыворотка (ПКЕ), содержащая А-специфические IgE-антитела в концентрации более, чем 3,5 КЕ/л IgE, готова к использованию, Р4Е - 1 фл.(0,1 мл).

Реагент 4G (P4G) - положительная контрольная сыворотка (ITKG), содержащая А-специфические IgG-антитела в концентрации более, чем 0,8 мкг/мл, готова к использованию, P4G - 1 фл. (0,1 мл).

Реагент 5Е (Р5Е) - коньюгат мышиных моноклональных антител (МКАТ) анти IgE человека с пероксидазой из корня хрена (коньюгат МКАТ анти IgE), 100-кратный концентрат, вязкая прозрачная жидкость голубого цвета (ЦНИИРИ, ООО «Полигност», Россия, ЭПР №896-99, ФСП 42-0190-0593-00), Р5Е - 1 фл. (0,13 мл).

Реагент 5G (P5G) - конъюгат мышиных моноклональных антител (МКАТ) анти IgG человека с пероксидазой их корня хрена (конъюгат МКАТ анти IgG), 100-кратный концентрат, вязкая прозрачная жидкость голубого цвета (ЦНИИРИ, ООО «Полигност», Россия, ЭПР №896-99,ФСП 42-0190-0593-00 от 16.01.2002 г.), P5G - 1 фл. (0,13 мл).

Реагент 6 (Р6) - промывающий и разводящий раствор, 10-кратный концентрат, прозрачная бесцветная жидкость, Р6 - 1 фл. (10 мл), (рН 7,2): трис гидроксиметилоксиметан, натрия хлорид, твин - 20 (фирма Sigma, США, кат. №Т67-91, ГОСТ 62 59-75, фирма Serva, Германия, кат. №37470).

Реагент 7 (Р7) - хромоген тетраметилбензидин (ТМБ), прозрачная бесцветная жидкость, Р7 - 1 фл. (12 мл) (ООО «Протеиновый контур», Россия, код М 040).

Реагент 8 (Р8) - субстрат перекись водорода, прозрачная бесцветная жидкость, Р8 -1 фл. (12 мл) (ООО «Протеиновый контур», Россия, код М 040).

Реагент 9 (Р9) - стоп - реагент, прозрачная бесцветная жидкость, кислота серная Н ₂SO₄ IN, P9 - 1 фл. (12 мл) (ГОСТ 4204-79).

Реагенты набора ИФТС вносят в лунки по стадиям в следующем порядке (таблицы 1, 2, 3, 4):

- После внесения реагентов, планшеты закрывают крышками и перемешивают содержимое лунок на шейкере в течение 30 секунд, после чего инкубируют планшеты при температуре (37±1)°С в течение 1 часа.

- Отмывка. По окончании инкубации удаляют содержимое лунок декантированием и промывают лунки 3 раза. При каждой промывке вносят во все лунки по 200 мкл рабочего промывающего раствора №1. Выдерживают в течение 1 минуты с последующим декантированием. При каждом декантировании тщательно удаляют остатки жидкости из лунок постукиванием планшетов в перевернутом положении по фильтровальной бумаге.

- Во все лунки одного планшета вносят по 100 мкл рабочего раствора коньюгата P5E, другого планшета - по 100 мкл раствора коньюгата P5G. Закрывают планшеты крышками и инкубируют при температуре 37°С в течение 1 часа.

- Отмывка. По окончании инкубации удаляют содержимое лунок и промывают лунки 3 раза так, как это указано на первом этапе, после чего промывают лунки 2 раза дистиллированной водой (по 200 мкл в лунку). Удаляют следы жидкости из лунок постукиванием планшета в перевернутом положении по фильтровальной бумаге.

- Вносят во все лунки планшетов по 100 мкл субстрат - хромогенной смеси (Р7+Р8) (раствор №3), закрывают планшеты крышками и инкубируют в течение 15-20 минут в темном месте при комнатной температуре с постоянным перемешиванием на шейкере; при этом содержимое лунок окрашивается в голубой цвет.

- Вносят во все лунки по 50 мкл стоп - реагента (Р9) и перемешивают содержимое лунок осторожным окачиванием планшета, при этом содержимое лунок окрашивается в ярко-желтый цвет.

- Измеряют величину оптической плотности (ОП) растворов в лунках планшетов на фотометре вертикального сканирования при длине волны 450 нм сразу после остановки реакции.

Далее производят учет результатов.

Рассчитывают среднее арифметическое значение оптической плотности (ОП) для лунок, содержащих отрицательную контрольную сыворотку(ОК), для лунок, содержащих положительную контрольную сыворотку (ПК) и для каждой пары лунок, содержащих референс - сыворотки Р2Е и P2G.

Анализ считается специфичным, чувствительным и действительным, если:

- Разница значений ОП отрицательной (ОК) и положительной (ПК) контрольной сывороток находится в пределах ед. ОП не менее 0,2.

- Показатель ОП положительной контрольной сыворотки (ПКЕ) должен быть не менее 0,3, a ITKG - не менее 0,8. Сравнивают ОП образца сыворотки (ОС) с ОП референс - сывороток Р2Е _1-4к и Р2G_1-4к определяют соответственный уровень (класс) для каждого образца сыворотки (ОС) (таблица 5, 6).

- если ОП образца сыворотки (ОС ) ниже ОП референс - сыворотки Е_1к, результат отрицательный (-);

- если ОП_ОС ниже ОП, но выше ОП_ОК - результат сомнительный (±);

- если ОП_ОС выше ОП, но ниже ОП - уровень специфических IgE низкий (1 класс);

- если ОП_ОС выше ОП, но ниже ОП - средний уровень ( 2 класс);

- если ОП _ОС выше ОП, но ниже ОП - умеренно-высокий уровень (3 класс);

- если ОП _ОС соответствует ОП - высокий уровень (4 класс);

- если ОП _ОС выше ОП - очень высокий.

Для стандартизации ИФТС проверяются показатели:

- чувствительность - как минимальный уровень специфических IgE- и IgG-антител (1 класс), при котором еще можно обнаружить в ИФА реакции различие в ОП между референс - сыворотками с низким уровнем антител и отрицательной контрольной сывороткой;

- точность - как способность ИФТС давать одинаковые результаты при тестировании одной и той же сыворотки, содержащей специфические антитела к грибковым аллергенам на 1 стрипе в 8 репликатах, и выражается коэффициентов вариации;

- специфичность - как способность конъюгатов в ИФА реакции вступать во взаимодействие с положительными контрольными сыворотками и не вступать в реакцию с отрицательной контрольной сывороткой.

Проведены клинические испытания предлагаемой полезной модели на двух группах больных. Результаты обследования приведены в табл. 7.

Из таблицы 7 следует, что сенсибилизация к грибковым аллергенам проявляется как немедленными реакциями (IgE - антитела), так и клеточно-опосредованными, замедленными (IgG - антитела). Обнаружены аллергенспецифические IgE - антитела в первой группе больных с БА и ХОБ в 30-86% образцов и в 18-45% - во второй группе с аллергическими заболеваниями. IgG - антитела выявлены в первой группе - в 57-95%, во второй группе - в 42-72% случаев. Полученные данные показывают, что при сенсибилизации к грибковым аллергенам обнаруживаются более высокие уровни антител класса IgG - в 76 и 57% случаев (средние значения) у больных I и II групп в сравнении с IgE - антителами - в 58-30% случаев, соответственно. Выявление специфических антител классов иммуноглобулинов IgE и IgG необходимо для дифференциальной диагностики микозов и последующей специфической терапии.

Таким образом, предлагаемая полезная модель:

1. позволяет выявлять одновременно специфические антитела классов IgE и IgG к грибковым аллергенам;

2. обладает высокой чувствительностью, точностью и специфичностью;

3. безопасна в диагностике, проста в постановке ИФА реакции, не требует дорогостоящего оборудования;

4. возможно использование полезной модели в любой клинической лаборатории, имеющей спектрофотометр вертикального сканирования.

Тест-система иммуноферментная для полуколичественного определения аллергенспецифических IgE и IgG-антител для диагностики микозов (ИФТС-мико-IgE-IgG-AT), включающая набор реагентов, референс-сыворотки, отличающаяся тем, что тест-система представляет собой комплект в одной коробке, содержащей два 96-луночных стрипированных планшета, в которых лунки первого и второго вертикальных рядов сорбированы аллергеном (А) из пыльцы амброзии; лунки с третьего по двенадцатый ряд сорбированы грибковыми аллергенами десяти видов, а также содержащий реагент 2Е и 2G - человеческие референс-сыворотки с различным содержанием специфических IgE и IgG-антител к аллергену (А), реагент Р3 - отрицательная контрольная сыворотка, не содержащая А - специфических IgE и IgG-антител, реагент 4Е - положительная контрольная сыворотка, содержащая А - специфические Ig-E-антитела, реагент 4G - положительная контрольная сыворотка, содержащая А - специфические Ig-G-антитела, реагент 5Е - конъюгат мышиных моноклональных антител анти IgE человека, реагент 5G - конъюгат мышиных моноклональных антител анти IgG человека, реагент Р6 - промывающий и разводящий раствор, реагент Р7 - хромоген тетраметилбензидин, реагент Р8 - субстрат перекиси водорода, реагент Р9 - стоп-реагент.