Устройство для идентификации последовательностей нуклеотидов

Полезная модель относится к области молекулярной биологии и биохимии и может быть использована для идентификации последовательностей нуклеотидов биологических и синтетических объектов. Устройство позволяет проводить качественный и количественный анализ последовательностей нуклеотидов, упрощает известное устройство для идентификации последовательности нуклеотидов за счет устранения необходимости использования источника света с высокостабилизированным по интенсивности потоком светового излучения, повышает точность идентификации последовательностей нуклеотидов с 75% (прототип) до 90% и расширяет арсенал технических средств, которые могут быть использованы для идентификации последовательностей нуклеотидов. Это достигается за счет того, что в устройстве для идентификации последовательностей нуклеотидов исследуемых объектов, состоящем из источника света, излучение от которого направлено на прозрачную подложку с иммобилизованными на ее поверхности олигонуклеотидами и расположенной под ней системой детекции интенсивности света, прошедшего через подложку, подложка содержит не менее двух зон, на поверхности одной из которых иммобилизован слой олигонуклеотидов, неспецифических к исследуемой последовательности нуклеотидов, а на поверхности другой зоны иммобилизован слой олигонуклеотидов, специфических к исследуемой последовательности нуклеотидов, а система детекции содержит не менее двух фоточувствительных независимых секций, каждая из которых освещена нерассеянным излучением, прошедшим только через одну зону.

Полезная модель относится к области молекулярной биологии и биохимии, и может быть использована для идентификации последовательностей нуклеотидов биологических и синтетических объектов, например, для идентификации генов, бактерий, вирусов и т.д.

Известно устройство для идентификации последовательностей нуклеотидов, состоящее из источника света, излучение от которого направлено на отражающую подложку с иммобилизованными на ее поверхности олигонуклеотидами, и системы детекции отраженного от подложки света (Elza Hutter, Marie-Paule Pileni, Detection of DNA Hybridization by Gold Nanoparticle Enhanced Transmission Surface Plasmon Resonance Spectroscopy // The Journal of Physical Chemistry B, V.107, 27, 2003, p.6497-6499).

Известно устройство для идентификации последовательностей нуклеотидов, состоящее из просвечивающего электронного микроскопа, излучение от источника света которого направлено на прозрачную подложку с иммобилизованными на ее поверхности олигонуклеотидами (Elza Hutter, Marie-Paule Pileni, Detection of DNA Hybridization by Gold Nanoparticle Enhanced Transmission Surface Plasmon Resonance Spectroscopy // The Journal of Physical Chemistry B, V.107, 27, 2003, p.6497-6499).

Наиболее близким к заявляемому является известное устройство для идентификации последовательностей нуклеотидов, состоящее из источника света, излучение от которого направлено на прозрачную подложку с иммобилизованными на ее поверхности олигонуклеотидами, и расположенной под ней системой детекции интенсивности света, прошедшего через подложку (патент РСТ WO 01/18242 A1, кл. C12Q 1/68) - прототип. В данном техническом решении использована комбинированная горизонтальная подложка, способная как пропускать, так и частично отражать падающий на нее свет, состоящая из основания и верхней части подложки. На верхней внешней части подложки иммобилизованы олигонуклеотиды, специфические к различным последовательностям нуклеотидов исследуемых объектов. В данном техническом решении использованы источники света с высокостабилизированным по интенсивности потоком светового излучения, что обусловлено конструктивными особенностями известного устройства.

Недостатками известного технического решения является его относительная сложность, связанная с его конструктивными особенностями, а также то, что данное устройство не позволяет осуществлять анализ с последовательностей нуклеотидов с высокой точностью.

Задачами полезной модели являются упрощение известного устройства для идентификации последовательностей нуклеотидов, разработка устройства, позволяющего осуществлять идентификацию последовательностей нуклеотидов с более высокой точностью, а также расширение арсенала технических средств, дающих возможность идентифицировать последовательность нуклеотидов.

Техническая задача полезной модели заключается в упрощении устройства для идентификации последовательностей нуклеотидов и повышении точности идентификации последовательностей нуклеотидов.

Указанный технический результат достигается тем, что в известном устройстве для идентификации последовательностей нуклеотидов, состоящем из источника света, излучение от которого направлено на прозрачную подложку с иммобилизованными на ее поверхности олигонуклеотидами, и расположенной под ней системой детекции интенсивности света, прошедшего через подложку, подложка содержит не менее двух зон, на поверхности одной из которых иммобилизован слой олигонуклеотидов, неспецифических к исследуемой последовательности нуклеотидов, на поверхности другой зоны иммобилизован слой олигонуклеотидов, специфических к исследуемой последовательности нуклеотидов, а система детекции содержит не менее двух независимых фоточувствительных секций, каждая из которых освещена нерассеянным излучением, прошедшим только через одну зону.

Предлагаемое техническое решение является новым и не описано в научно-технической литературе.

Предлагаемая полезная модель может быть использована для идентификации последовательностей нуклеотидов биологических и синтетических объектов, например, таких как гены, бактерии, вирусы и т.д. При этом исследуемые последовательности нуклеотидов могут отличаться как по химическому составу (строению), так и по количеству содержащихся в них звеньев.

В полезной модели могут быть использованы различные источники света, например, такие как, лазерный модуль, ртутная лампа, светодиод и т.д.. При этом в отличие от прототипа в устройстве не обязательно использовать источники света с высокостабилизированным по интенсивности потоком светового излучения, что упрощает предлагаемое устройство.

Предлагаемое техническое решение позволяет проводить как качественный, так и количественный анализ последовательностей нуклеотидов в исследуемых объектах. При проведении количественного анализа целесообразнее использовать источники света с равномерным распределением интенсивности светового излучения. В данном техническом решении источник сета должен располагаться так, чтобы его излучение было направлено на каждую из зон прозрачной подложки.

В предлагаемом устройстве подложка содержит не менее двух зон, на поверхности одной из которых иммобилизован слой олигонуклеотидов, неспецифических к исследуемой последовательности нуклеотидов, а на поверхности другой зоны иммобилизован слой олигонуклеотидов, специфических к исследуемой последовательности нуклеотидов. При этом зоны могут как соприкасаться, но не пересекаться друг с другом, так и быть отделены друг от друга пространством, перегородкой и т.д. Наличие в предлагаемом техническом решении в отличие от прототипа не менее двух зон в сочетании с нижеописанной системой детекции дает возможность повысить точность идентификации последовательностей нуклеотидов. При этом на одной из зон обязательно должны быть иммобилизованы неспецифические олигонуклеотиды для того, чтобы исключить влияние актов неспецифического связывания, а также исключить нежелательное влияние флуктуаций интенсивности света по ходу эксперимента. Каждая другая зона содержит иммобилизованные на поверхности подложки олигонуклеотиды, специфические только к одному исследуемому объекту. Площадь каждой из зон может быть как одинаковой, так и отличаться друг от друга. Во втором случае вводят поправочные коэффициенты, учитывающие площадь каждой из зон.

Для изготовления подложки могут быть использованы различные прозрачные материалы, например, такие как стекло, кварц, слюда и т.д. При этом также можно использовать подложки, содержащие тонкие слои напыленных материалов, что обеспечивает дополнительную возможность для ковалентной иммобилизации специфических и неспецифических олигонуклеотидов. При этом толщина и геометрические размеры подложки в зависимости от решаемой задачи могут варьироваться в широких пределах.

Иммобилизацию специфических и неспецифических олигонуклеотидов на поверхности подложки можно осуществлять различными известными методами. При этом возможна как химическая иммобилизация олигонуклеотидов с использование различных химических соединений, содержащих якорные группы, так и физическая иммобилизация, основанная, например, на электростатическом взаимодействии. Плотность иммобилизованных на поверхности подложки специфических и неспецифических олигонуклеотидов может варьироваться в широких пределах в зависимости от решаемой конкретной технической задачи.

Таким образом, в предлагаемой полезной модели описан материал, из которого выполнена каждая из зон подложки.

В предлагаемой полезной модели система детекции содержит не менее двух фоточувствительных независимых секций, в качестве которых могут быть использованы, например, двухсекционный фотодиод, КМОП матрица (светочувствительная матрица, выполненная на основе комплементарной металлооксидной полупроводниковой технологии), прибор с зарядовой связью (ПЗС матрица) и т.д. Количество фоточувствительных секций должно совпадать с количеством вышеописанных зон. Каждая из фоточувствительных секций может состоять, например, как из одной, так и нескольких фотодиодных секций, может представлять собой как всю матрицу, так и часть КМОП матрицы, ПЗС матрицы или других фоточувствительных элементов. При этом фоточувствительные секции должны быть независимы и располагаться так, чтобы нерассеянный свет, проходящий через одну зону подложки, попадал только на одну секцию, а нерассеянный свет, прошедший через другую зону, попадал только на другую секцию. Рассеянное излучение, обусловленное методикой эксперимента, может одновременно попадать на одну либо несколько секций, и, как правило, вносит несущественный вклад в экспериментальные результаты.

Предлагаемая полезная модель работает следующим образом. На поверхности разных зон подложки известными приемами иммобилизируют специфические и неспецифические олигонуклеотиды к исследуемому объекту. После этого проводят измерения разности интенсивности света, прошедшего через разные зоны подложки. Таким образом, получают сигнал, соответствующий нулевой концентрации исследуемых соединений. Известными биохимическими методами нарабатывают исследуемые последовательности нуклеотидов. Дальнейший анализ может проводиться, например, двумя известными способами. Первый из них заключается в предварительной иммобилизации исследуемых последовательностей нуклеотидов на поверхности носителя (наночастиц) с последующей обработкой вышеназванных зон подложки суспензией модифицированных наночастиц. При этом происходит адсорбция наночастиц на поверхности соответствующих зон подложки за счет комплементарного связывания специфических олигонуклеотидов с идентифицируемой последовательностью нуклеотидов. В зонах, содержащих неспецифические олигонуклеотиды к идентифицируемой последовательности нуклеотидов, вышеуказанного комплементарного связывания не происходит, в результате сорбция наночастиц на поверхности этих зон практически отсутствует.

Другой известный способ заключается в предварительном введении биотина в исследуемую последовательность нуклеотидов. Затем поверхность подложки, содержащую иммобилизированные олигонуклеотиды, обрабатывают раствором исследуемых последовательностей нуклеотидов, модифицированных биотином, в результате чего происходит комплементарное связывание специфических олигонуклеотидов с идентифицируемой последовательностью нуклеотидов на поверхности зон подложки. После этого модифицированную таким образом подложку обрабатывают суспензией наночастиц, содержащих химически связанные с ними срептавидин. При этом наночастицы сорбируются только в тех зонах, где произошло комплементарное связывание биотина со стрепатвидином.

В обоих способах перед измерениями подложку промывают для удаления не вступивших в реакцию реагентов. Затем измеряют разность интенсивности света, прошедшего через специфические и неспецифическую зону подложки. Изменение разности интенсивности пропорционально количеству сорбированных наночастиц, которая соответствует определенной концентрации исследуемых последовательностей нуклеотидов в растворе. Это позволяет проводить как качественный, так и количественный анализ исследуемых последовательностей нуклеотидов.

Преимущества предлагаемой полезной модели иллюстрируют следующие примеры.

Пример 1 (качественный анализ)

В опыте используют устройство (систему) для идентификации последовательностей нуклеотидов, имеющее источник света, в качестве которого оно содержит светодиод белого света, излучение от которого направлено на прозрачную стеклянную подложку с двумя отделенными друг от друга зонами. Одна из зон содержит на рабочей поверхности химически иммобилизованные олигонуклеотиды, специфические к последовательности нуклеотидов бактерии E.coli, а другая зона содержит на рабочей поверхности химически иммобилизованные олигонуклеотиды, неспецифические к последовательностям нуклеотидов E.coli. В качестве системы детекции устройство содержит двухсекционный фотодиод марки Наташами (Япония), расположенный так, что нерассеянный свет, прошедший через одну зону подложки, попадает только на одну секцию фотодиода, а нерассеянный свет, прошедший через другую зону, попадает на другую секцию.

Качественную идентификацию (анализ) последовательностей нуклеотидов E.coli с помощью данного устройства проводят следующим образом. Предварительно проводят измерения разности интенсивности света, прошедшего через разные зоны подложки. После этого биотин химически прививают к исследуемой последовательности нуклеотидов E.coli, а белок стрептавидин к поверхности наночастиц кремния с диаметром частиц 100 нанометр (нм). Затем поверхность подложки, содержащую иммобилизированные олигонуклеотиды, обрабатывают исследуемым раствором последовательностей нуклеотидов, модифицированных биотином, в результате чего происходит комплементарное связывание специфических олигонукелотидов с идентифицируемой последовательностью нуклеотидов на поверхности зоны подложки. После этого модифицированную таким образом подложку обрабатывают суспензией наночастиц, содержащих химически связанный с ними стрептавидин. При этом наночастицы сорбируются только в зоне, где произошло связывание биотина со стрептавидином. После этого промывают подложку в буферном растворе и бидистиллированной воде для удаления не вступивших в реакцию реагентов и высушивают до постоянной массы. Затем измеряют разность интенсивности света, прошедшего через специфические и неспецифическую зоны подложки. Отклонение разности интенсивности от базового уровня говорит о присутствии последовательностей нуклеотидов E.coli в исследуемом растворе. Таким образом, данное устройство позволяет проводить качественный анализ последовательностей нуклеотидов с точностью 90%.

Затем производят аналогичный эксперимент, но только используют раствор с последовательностями нуклеотидов, не принадлежащих E.coli. Нулевое отклонение разности интенсивности от базового уровня говорит об отсутствии последовательностей нуклеотидов E.coli в исследуемом растворе

Пример 2 (количественный анализ)

В опыте используют устройство, аналогичное описанному в примере 1, однако используют набор растворов, содержащих известные концентрации последовательностей нуклеотидов E.Coli от 0 до 5000 нанограмм/миллилитр (нг/мл). Для каждого раствора определяют отклонение разности интенсивности света, прошедшего через разные зоны, от базового уровня. На основе этих данных строят градуировочный график зависимости отклонения разности интенсивности света от концентрации последовательностей нуклеотидов в исследуемом растворе.

Затем проводят аналогичный эксперимент с использованием раствора последовательностей нуклеотидов E.coli, взятых в концентрации 10 нг/мл. Измеряют отклонение разности интенсивности света, прошедшего через разные зоны, от базового уровня и по градуировочному графику определяют, что в исследуемом растворе присутствует последовательность нуклеотидов E.Coli в концентрации 9 нг/мл.

Эксперимент был проведен 5 раз, в результате было установлено, что точность определения концентрации последовательностей нуклеотидов составляет 90%.

Пример 3

Опыт проводят аналогично примеру 1, однако используют устройство, имеющее слюдяную подложку и содержащее 3 независимые зоны. Одна из зон содержит на рабочей поверхности химически иммобилизованные олигонуклеотиды, специфические к последовательности нуклеотидов бактерии E.coli, а другая зона содержит на рабочей поверхности химически иммобилизованные олигонуклеотиды, соответствующие специфическим участкам кодирующих генов бактериальных ферментов бета-лактамаз CTX-M типа, а третья зона содержит олигонуклеотиды, неспецифические к последовательностям нуклеотидов E.coli и бета-лактамаз CTX-M.

В опыте используют устройство, содержащее в качестве источника света твердотельный лазерный модуль LDM-5 Laserex Ltd. (Австралия), а в качестве системы детекции устройство имеет ПЗС матрицу, разделенную на три секции. При этом в устройстве лазерный модуль, подложка и ПЗС матрица, расположены так, что каждая из трех секций матрицы освещена нерассеянным излучением, прошедшим только через одну зону.

Эксперимент показывает, что данное устройство позволяет одновременно проводить качественный анализ различных последовательностей нуклеотидов с точностью 87%.

Пример 4

Опыт проводят аналогично примеру 1, однако используют устройство, имеющее подложку из полиметилметакрилата с тонким напылением золота. При этом на подложке одна из зон содержит на рабочей поверхности физически иммобилизованные олигонуклеотиды, соответствующие специфическим участкам кодирующих генов бактериальных ферментов бета-лактамаз TEM типа, а другая зона содержит на рабочей поверхности физически иммобилизованные олигонуклеотиды, неспецифические к последовательностям нуклеотидов бета-лактамаз TEM типа.

В опыте используют устройство, содержащее в качестве источника света ртутную лампу, а в качестве системы детекции устройство содержит КМОП матрицу, разделенную на две секции. При этом в устройстве ртутная лампа, подложка и КМОП матрица расположены так, что каждая из секций матрицы освещена нерассеянным излучением, прошедшим только через одну зону.

Эксперимент показывает, что данное устройство позволяет проводить качественный анализ последовательности нуклеотидов бета-лактамаз TEM типа с точностью 90%.

Пример 5 (контрольный, по прототипу)

Опыт проводят аналогично примеру 1, однако используют устройство только с одной зоной, содержащей на рабочей поверхности химически иммобилизованные олигонуклеотиды, специфические к последовательности нуклеотидов бактерии E.coli. Устройство имеет систему детекции, состоящую из одной фоточувствительной секции и содержит в качестве источника света гелий-неоновый лазер марки Coherent Inc с высокостабилизированным по интенсивности потоком светового излучения.

Эксперимент показывает, что данное устройство позволяет проводить качественный анализ последовательности нуклеотидов бактерии E.coli с точностью 75%.

Были проведены дополнительные эксперименты, которые показали, что предлагаемое устройство становится неработоспособным, если оно не будет содержать источник света, либо не будет содержать подложку с иммобилизованными на ее поверхности олигонуклеотидами или не будет содержать систему детекции света, прошедшего через подложку. Устройство также не работает, если в нем использована непрозрачная подложка или излучение от источника света не будет направлено на подложку. Устройство теряет работоспособность, если на каждой из его зон иммобилизованы олигонуклеотиды, только специфические или только неспецифические к исследуемой последовательности нуклеотидов. Устройство также становится неработоспособным, если в системе детекции каждая из независимых секций освещена нерассеянным излучением, прошедшим через разные зоны.

Таким образом, из приведенных примеров видно, что предложенное устройство действительно позволяет проводить качественный и количественный анализ последовательностей нуклеотидов, упрощает известное устройство для идентификации последовательности нуклеотидов за счет устранения необходимости использования с источника света с высокостабилизированным по интенсивности потоком светового излучения, повышает точность идентификации последовательностей нуклеотидов с 75% (прототип) до 90% и расширяет арсенал технических средств, которые могут быть использованы для идентификации последовательностей нуклеотидов.

Устройство для идентификации последовательностей нуклеотидов, состоящее из источника света, излучение от которого направлено на прозрачную подложку с иммобилизованными на ее поверхности олигонуклеотидами и расположенной под ней системой детекции интенсивности света, прошедшего через подложку, отличающееся тем, что подложка содержит не менее двух зон, на поверхности одной из которых иммобилизован слой олигонуклеотидов, неспецифических к исследуемой последовательности нуклеотидов, а на поверхности другой зоны иммобилизован слой олигонуклеотидов, специфических к исследуемой последовательности нуклеотидов, а система детекции содержит не менее двух фоточувствительных независимых секций, каждая из которых освещена нерассеянным излучением, прошедшим только через одну зону.