Устройство для определения содержания метанола и формальдегида на основе бактериального штамма methylobacterium dichloromethanicum дм 4 вкм в-2191
Полезная модель относится к области биотехнологии и экологическому мониторингу, а именно, к биосенсорному аналитическому устройству, которое может быть использовано для определения содержания метанола и формальдегида. Устройство для определения метанола и формальдегида содержит измерительную кювету с магнитной мешалкой и биосенсор для определения этанола, включающий электрод Кларка, на котором размещен биорецептор в виде иммобилизованных на носителе клеток штамма бактерий М. dichloromethanicum ДМ4 VKM В-2191.
Метанол используется в различных промышленных и технологических процессах. Российская Федерация является основным производителем и поставщиком метанола в Европе. Мировое производство метанола в настоящее время составляет 50 млн. т. в год, причем большая часть используется на химический синтез [http://methanol.ru/market/Rossijskij_rynok_metanola_v_svete_mirovyh_tenden]. Метанол применяется в качестве ингибитора гидратообразования при добыче газа. Следствием производства и применения метанола является загрязнение воды и почвы, что представляет серьезную экологическую проблему [http://www.ogbus.ru. Нефтегазовое дело, 2007]. Метанол также используется для производства формальдегида, сложных эфиров, аминов, растворителей, уксусной кислоты.
Другим широко используемым в промышленности химическим соединением является формальдегид. Ежегодное производство формальдегида составляет около 10 миллионов тонн. Половина этого объема используется для производства формальдегидных смол, применяемых в производстве строительных плит, фанеры, лакированных материалов [Gerberich H.R., Seaman G.C., 1994. Formaldehyde. Encyclopaedia of Chemical Technology, 4th ed., vol. 11. Wiley, New York, pp.929-951].
Поиск новых способов и технологий биодеградации и детекции метанола и формальдегида на основе штаммов микроорганизмов-деструкторов может решить проблему очистки окружающей среды от этих соединений. Применению биосенсорного анализа для изучения биокаталитических свойств клеток микроорганизмов посвящено большое число публикаций. Существующие разработки в области биосенсоров для детекции метанола и формальдегида основаны на сочетании ферментов или клеток микроорганизмов и амперометрических (кислородный электрод типа Кларка, медиаторные электроды) или потенциометрических преобразователей (pH-чувствительные транзисторы).
Ниже перечислены аналоги предлагаемого микробного сенсора для контроля концентрации метанола и формальдегида.
Два типа селективных биосенсоров для определения формальдегида разработаны на базе pH-чувствительных полевых транзисторов в качестве преобразователей [Korpan Y.I., Gonchar M.V., Sibirny А.А., Martelet С., El'skaya A.V., Gibson T.D., Soldatkin A.P. Development of highly selective and stable potentiometric sensors for formaldehyde determination // Biosensors and Bioelectronics. 2000. V.15. 1-2. P.77-83]. В качестве биологически чувствительных элементов были использованы алкогольоксидаза и клетки метилотрофных дрожжей, обработанные дигитонином. Время отклика составляло 10-60 и 60-120 с для ферментного и клеточного сенсоров, соответственно. Линейный диапазон детекции составлял для ферментного сенсора 5-200 мМ и 5-50 мМ для микробного. Стабильность при хранении составляла 60 и 30 дней для ферментного и микробного сенсоров, соответственно. Сенсоры обладали высокой селективностью к формальдегиду и характеризовались отсутствием отклика на первичные спирты включая метанол, а также на глицерин и глюкозу. Биосенсор медиаторного типа на основе клеток метилотрофных дрожжей Hansenula polymorpha представлен в работе [Khlupova M., Kuznetsov В., Demkiv О., Gonchar M., Csöregi ., Shleev S.. Intact and permeabilized cells of the yeast Hansenula polymorpha as bioselective elements for amperometric assay of formaldehyde // Talanta. 2007. V.71. 2. P.934-940]. Клетки иммобилизовали включением в кальций-альгинатный гель на поверхности платиновых электродов, полученных методом трафаретной печати. В качестве медиатора использовали 2,6-дихлорфенолиндофенол. Нижний предел детекции формальдегида составлял 0.74 мМ.
В качестве прототипа использован амперометрический биосенсор на основе клеток Hansenula polymorpha. Биосенсоры на основе мутантных клеток метилотрофных дрожжей Hansenula polymorpha для детекции этанола и метанола описаны Гончаром с соавт., 1998 [Gonchar M.V., Maidan М.М., Moroz О.М., Woodward J.R. Sibirny A.A. Microbial O2- and H2O2-electrode sensors for alcohol assays based on the use of permeabilized mutant yeast cells as the sensitive bioelements // Biosens. Bioelectron 1998. V.13. P.945-952.]. Биосенсор на основе O2-электрода содержал мутантные клетки с повышенной алкогольоксидазной активностью. Биосенсор, использующий в качестве преобразователя Н2 O2-электрод, содержал мутантные клетки дефицитные по каталазе, которые продуцировали Н2O2 при окислении спирта. Оба штамма были обработаны дигитонином, что позволяло значительно снизить чувствительность к глюкозе и глицерину и повысить селективность биосенсоров. Линейные диапазоны определения этанола и метанола для биосенсора на основе кислородного электрода составляли 0.2-1.2 и 0.03-0.35 мМ, соответственно. Биосенсор, основанный на детекции пероксида водорода, позволял определять этанол и метанол в диапазонах 0.4-4 мМ и 0.05-1.2 мМ, соответственно.
Таким образом, существующие разработки в области микробных биосенсоров для детекции метанола и формальдегида основаны на использовании клеток метилотрофных дрожжей. Актуальной остается задача поиска бактериальных штаммов для создания биосенсоров на их основе.
В отличие от вышеуказанного прототипа в предлагаемой модели используется бактериальный штамм Methylobacterium dichloromethanicum ДМ 4 VKM В-2191=DSMZ 6343, выделенный из активного ила [Doronina N.V., Trotsenko Y.A., Tourova Т.Р., Kuznetsov B.B. and Leisinger T. Methylopila helvetica sp. nov. and Methylobacterium dichloromethanicum sp. nov. - Novel Aerobic Facultatively Methylotrophic Bacteria Utilizing Dichloromethane // System. Appl. Microbiol. 2000. V.23. P.210-218]. Штамм, используемый при создании полезной модели, нечувствителен к глюкозе, обладает способностью окислять метанол, формальдегид и ряд алифатических спиртов.
Задача, на решение которой направлена заявляемая полезная модель состоит в создании устройства для определения содержания метанола и формальдегида и применении в таких областях как мониторинг окружающей среды и химическая промышленность.
Технический результат, который может быть получен при использовании предлагаемой полезной модели, заключается в том, что предлагаемый биосенсор позволяет исследовать кажущиеся кинетические параметры иммобилизованных клеток и обладает малым временем ответа, высокой чувствительностью и стабильностью.
Сущность полезной модели заключается в том, что биосенсор для определения метанола и формальдегида включает электрод Кларка, сопряженный с биорецептором, содержащим иммобилизованные на носителе клетки штамма бактерий M. dichloromethanicum ДМ4 VKM В-2191. Штамм чувствителен к наличию метанола, формальдегида и ряда алифатических спиртов и нечувствителен к наличию глюкозы.
Бактерии выращивали на среде «К», содержащей (г/л): КН2РO4 - 2, (NH4) 2SO4 - 2, NaCl - 0.5, MgSO4×7H 2O - 0.125, FeSO4×7H2O - 0.002, pH 7.2, при 29°С в колбах объемом 0.75 л на качалке (180 об/мин). Культивирование проводили в колбах объемом 750 мл до необходимой плотности при 29°С и аэрация на шейкере при 190 об/мин. Инокулят вносили в количестве 1% по объему среды до конечной концентрации ~106 КОЕ/мл. Метанол вносили в стерильные среды в концентрации 0.5% (по объему).
Измерения проводили в открытой кювете. Для регистрации сигналов сенсора использовали гальваностат-потенциостат IPC2L (ООО «Кронас», Россия), подключенный к персональному компьютеру. Все измерения проводили в кювете объемом 2.0 мл при постоянном перемешивании и при температуре 20-22°С. После стабилизации базовой линии, в систему подавали раствор субстрата. В качестве базового раствора использовали 10 мМ калий-фосфатный буфер pH 7.
Для приготовления рецепторного элемента биосенсора использовали суспензию клеток бактерий M. dichloromethanicum ДМ4 VKM B-2191. Выращенные на вышеуказанной среде клетки, центрифугировали при 10000 g в течение 3 минут, затем промывали 2 раза калий-фосфатным буфером и суспендировали в определенное количество такого же буфера; 5 мкл суспензии клеток в концентрации 250 мг сырого веса/мл наносили на мембрану (3×3 мм) и подсушивали на воздухе в течение 20 минут. Затем мембрану помещали на кислородный электрод типа Кларка и закрепляли с помощью фиксатора на поверхности преобразователя.
Принцип анализа был основан на электрохимической детекции дыхательной активности микроорганизмов в присутствии анализируемых соединений. Изменение содержания кислорода в среде пропорционально концентрации анализируемого вещества, что и составляет основу анализа. Регистрируемым параметром являлась максимальная скорость изменения сигнала (нА/с).
На фиг.1 представлена схема устройства для определения метанола и формальдегида. Предлагаемое устройство включает следующие элементы: биосенсор, состоящий из преобразователя-электрода Кларка (1), на котором размещен биорецептор (2), представляющий собой иммобилизованные на носителе клетки штамма бактерий M. dichloromethanicum ДМ4 VKM B-2191, а также измерительную кювету (3) и магнитную мешалку (4).
Основным аналитическим параметром биосенсора является градуировочная зависимость. Для ее построения в измерительную кювету вносили различные концентрации анализируемых соединений. На фиг.2 представлены градуировочные зависимости сенсора на основе клеток штамма M. dichloromethanicum ДМ4 VKM В-2191 для определения метанола (кривая 1) и формальдегида (кривая 2).
Основные аналитические параметры биосенсора представлены в Таблице 1. Кажущиеся кинетические константы приведены в Таблице 2.
Таблица 1. | ||
Аналитические параметры биосенсора на основе штамма M. dichloromethanicum ДМ4 VKM B-2191. | ||
Аналитические параметры сенсора | Субстракт | |
метанол | формальдегид | |
Чувствительность в области линейного диапазона, (нА/с)/мМ/мм2 | 27 | 27 |
Минимальный предел обнаружения, мМ | 0.05 | 0.04 |
Диапазон детекции, мМ | 0.05-2.50 | 0.04-2.00 |
Коэффициент вариации, % | 8.2 | |
Операционная стабильность без потери активности, сут | 7 | |
Таблица 2. | ||
Кинетические константы иммобилизованных клеток M. dichloromethanicum ДМ4 VKM B-2191. | ||
Параметры уравнения Хилла | Субстрат | |
метанол | формальдегид | |
Максимальная скорость реакции Vmax, нА/с | 1.73 | 1.40 |
Констата Михаэлиса KM, мМ | 0.57 | 0.50 |
Параметр Хилла, h | 2.00 | 1.80 |
В Таблице 3 приведена субстратная специфичность штамма М. dichloromethanicum ДМ4 VКМ В-2191.
Таблица 3. | |
Субстратная специфичность штамма M. dicloromethanicum ДМ4 VKM В-2191. | |
Субстрат | Отклик сенсора, % |
метанол | 100 |
этанол | 81.5 |
пропанол | 71.6 |
бутанол | 63.0 |
пентанол | 17.3 |
изопропанол | 0.0 |
изобутанол | 0.0 |
изоамиловый спирт | 0.5 |
третбутанол | 0.0 |
глицерин | 0.0 |
формальдегид | 96.0 |
формиат | 16.5 |
глюкоза | 0.0 |
Согласно данным субстратной специфичности, штамм характеризовался наибольшими откликами на метанол, этанол, пропанол и бутанол. Отклик на формальдегид составлял 96% ответа на метанол.
В результате проведенных исследований установлены основные свойства штамма M. dicloromethanicum ДМ4 VКМ В-2191, на основании чего, предлагаемый штамм может быть рекомендован для использования в технологии производства амперометрических биосенсоров для определения концентрации метанола и формальдегида при проведении экологического мониторинга.
Устройство для определения содержания метанола и формальдегида содержит измерительную кювету с магнитной мешалкой и биосенсор для определения метанола и формальдегида, включающий электрод Кларка, на котором размещен биорецептор в виде иммобилизованных на носителе клеток бактерий Methylobacterium dichloromethanicum ДМ4 ВКМ В-2191.