Устройство для приготовления двойной эмульсии и амплификации во внутренней водной фазе с помощью цифровой пцр специфичных фрагментов нуклеиновых кислот

Полезная модель может быть использована при проведении научных исследований в области физико-химической биологии, биотехнологии и медицине, а также для ДНК-диагностики. Устройство основано на использовании микрофлуидной технологии и рассчитано на приготовление чипа для проведения ПЦР, состоящего из разделенных спейсером двух предметных стекол, в пространстве между которыми размещается среда для амплификации специфичных фрагментов нуклеиновых кислот с помощью цифровой полимеразной цепной реакции. Отличительными особенностями данного чипа служат двойная эмульсия «вода-масло-вода» с затвердевающей (полимеризующейся) внешней фазой, приклеивающейся к стеклу во время полимеризации и выполняющей роль фиксатора образцов (монокапель), содержащих все необходимые ингредиенты для проведения ПЦР, включая интеркалирующий краситель SYBR Green I или ему подобный, а также анализируемый образец нуклеиновых кислот.Вместо интеркалирующих красителей могут использоваться системы детекции произошедшей амплификации с помощью разнообразных гибридизационных зондов. Средний (масляный) слой необходим для пространственного разобщения и исключения испарения водных монокапель внутренней фазы. Амплификация проводится в подходящем ДНК-термоциклере, температурные и временные параметры которой зависят от особенностей амплифицируемых фрагментов нуклеиновых кислот. По завершению ПЦР данный чип помещается на столик подходящего флуоресцентного микроскопа, снабженного цифровой фотокамерой, и происходит регистрация свечения соответствующего флуоресцентного красителя, свидетельствующая о прошедшей амплификации и, следовательно, о наличии искомой последовательности нуклеиновых кислот в конкретных монокаплях.

Полезная модель относится к физико-химической биологии, биотехнологии и медицине и связана с анализом молекул нуклеиновых кислот путем амплификации их специфичных фрагментов. Она может быть использована при проведении количественной ДНК-диагностики в медицине, ветеринарии, санитарно-эпидемиологических исследованиях для обнаружения и подсчета возбудителей опасных инфекций, включая возможные биотеррористические атаки, в криминалистике для идентификации преступников, в пищевой промышленности при выявлении и количественной оценке в продуктах питания ингредиентов из генетически модифицированных организмов, определении качества сырья на предмет загрязнения нежелательными примесями и т.д. Устройство основано на использовании микрофлуидной технологии и рассчитано на приготовление двойной эмульсии «вода-масло-вода» («В-М-В») с затвердевающей (полимеризующейся) внешней фазой и на амплификацию во внутренней жидкой водной фазе с помощью цифровой полимеразной цепной реакции (цПЦР) специфичных фрагментов нуклеиновых кислот.

Современная ДНК-диагностика основана преимущественно на амплификации с помощью разнообразных ДНК-термоциклеров специфичных фрагментов ДНК или РНК с помощью ПЦР и ее модификаций, включая цПЦР. В настоящее время большинство ДНК-термоциклеров имеют нагреваемый и охлаждаемый элементами Пельтье реакционный блок, изготовленный из обладающего хорошей теплопроводностью металла, в котором обычно располагаются реакционные полипропиленовые пробирки емкостью от 0,1 до 1,5 мл, содержащие реакционные объемы от 10 до 30 мкл. Другим направлением в амплификации нуклеиновых кислот с помощью реакций, управляемых сменой температур, является создание различных микрожидкостных устройств, в которых объемы реакционных смесей существенно меньше, а типы реакционных сосудов гораздо разнообразнее. Микрожидкостную ПЦР можно подразделить на ПЦР со стационарными реакционными камерами в нанолитровом и пиколитровом диапазонах, на ПЦР в потоке жидкости, где объемы реакционных смесей также измеряются пико- и нанолитрами, на твердофазную ПЦР на чипах и на эмульсионную ПЦР, в которых объемы для отдельных независимых реакций амплификации варьируют от фемто- до нанолитров. Если в обычной ПЦР, как правило, реакционная смесь занимает лишь небольшую часть от общего объема сосуда, то в микрожидкостной ПЦР объем сосудов того или иного типа практически равен объему реакционной смеси. Причем сосудом может выступать не только в привычном понимании емкость с твердыми стенками, но и эмульгированные капли водной фазы, находящиеся в несмешивающейся с водой (масляной) фазе, или части гелевого пространства, или части водного раствора, непосредственно находящиеся в тесном контакте с местами, где происходит амплификация.

Проведение ПЦР в водно-масляной эмульсии было предложено ранее из-за того, что при обычной ПЦР имеет место некоторая избирательность накопления тех или иных ампликонов, которая при эмульсионной ПЦР ликвидируется или сводится к минимуму [Nakano et al., 2003; Musyanovych et al., 2005; Williams et al., 2006]. При этом в цитируемых работах авторами или по прошествии нескольких циклов, или в конце реакции эмульсия с помощью центрифугирования разделялась на две фазы - масляную и водную, приводя тем самым к смешиванию ампликонов из всех микрокапелек, где до этого шли свои независимые реакции амплификации. Известен также метод, получивший название BEAMing [Diehl et al., 2006], рассчитанный на то, что при образовании эмульсии во все или только в часть микрокапелек водного раствора, содержащего все необходимые ингредиенты для проведения ПЦР, попадут магнитные частички, покрытые стрептавидином. Ввиду того, что с этими магнитными частичками связывается биотинилированный праймер, происходит твердофазная амплификация ДНК, где из-за стерических ограничений большое значение имеет размер амплифицируемого фрагмента, причем показано, что эффективность размножения молекул ДНК с размерами 200 пар нуклеотидов и 2700 пар нуклеотидов составляет всего 30% и 5% от таковой для фрагмента длиной 110 пар нуклеотидов соответственно [Diehl et al., 2006].

В дальнейшем эмульсионная ПЦР заметно усовершенствовалась, и если на ранних этапах существования данного способа амплификации эмульсии готовились простым встряхиванием пробирки с водной и масляной фазами на шейкере, то позднее для смешивания потоков масла и воды, подаваемых с помощью шприцевых насосов, стали использовать специальные чиповые устройства Y- и/или Т-типов. Новой задачей эмульсионной ПЦР стало обеспечение проведения данной реакции в цифровом формате с целью высокоточного подсчета изначально присутствующего в анализируемом образце количества искомых копий молекул ДНК или РНК. Так, фирмой QuantaLife, Inc. предложена новая технология количественной (цифровой) ПЦР амплификации, названная Droplet Digital PCR, или сокращенно ddPCR. На основе данной технологии фирмой Bio-Rad Laboratories стал производиться монокапельный ДНК-термоциклер модели QX-100, где одновременно возможен анализ 8 образцов, но для каждого образца амплификация идет в 20 тысячах реакторов объемом в 1 нанолитр каждый [Hindson et al., 2011; Pinheiro et al.,2012].

Весьма важным моментом при проведении однофазной эмульсионной ПЦР является недопущение слияния капель водной фазы, в которых происходила амплификация. Одним из технических решений для достижения этого служит обеспечение затвердевания после завершения ПЦР водной фазы, что достигается благодаря тому, что в водной фазе, например, присутствует легкоплавкая агароза, находящаяся на стадиях денатурации, отжига и элонгации в расплавленном состоянии и не мешающая протеканию ПЦР [Leng et al., 2010; Zhu et al., 2012]. После завершения ПЦР и охлаждения реакционной смеси монокапельки, содержащиеся в водно-масляной эмульсии, становятся гелевыми моношариками, неспособными слиться друг с другом.

Наиболее близким к предлагаемому нами способу обращения с единичными молекулами ДНК или РНК с помощью цифровой ПЦР в двухфазной эмульсии «В-М-В» является известный способ размножения нуклеиновых кислот в бесклеточной системе в виде так называемых молекулярных n олимеразных колоний (полоний), когда под действием термостабильной ДНК полимеразы в полиакриламидном геле с помощью ПЦР происходит амплификации фрагментов ДНК или РНК [Четверин, Четверина, 1995; 1998; Chetverin, Chetverma, 1997; 1999]. Однако данный способ недостаточно технологичен из-за многостадийности приготовления слоя полиакриламидного геля, содержащего в случайных местах единичные молекулы нуклеиновых кислот, пригодные к размножению.

Другим серьезным недостатком является заведомо меньший коэффициент размножения молекул ДНК в геле, чем при проведении ПЦР в растворе из-за меньшей диффузии и прочих стерических ограничений, накладываемых ячеистой или иной структурой геля, которые к тому же прямо пропорционально нарастают при амплификации более протяженных фрагментов ДНК. В данном подходе при формировании среды для амплификации отдельных молекул нуклеиновых кислот не используется микрофлуидная технология, позволяющая с помощью изменения (выбора) диаметров каналов и скорости потоков жидкостей (водной и масляной фаз) регулировать диаметр (объем капель) и фактически количество реакционных сосудов (монокапелек водной фазы) для определенного выбранного для эксперимента объема жидкости.

Сущность данного изобретения заключается в том, что работа с единичными молекулами ДНК или РНК и их амплификация с помощью ПЦР может вестись в отдельных независимых реакционных сосудах, формируемых при создании двойной эмульсии «В-М-В», главным отличием которой от используемых в настоящее время является наличие внешней затвердевающей (полимеризующейся) фазы, формирующейся из мономеров полиакриламидного геля или иной субстанции, соответствующей необходимым требованиям в виде прозрачности среды, ее инертности для ДНК полимераз и прочих ферментов нуклеинового обмена и способности выдержать флуктуации температур в нужном при проведении ПЦР диапазоне. Как известно, ПЦР обычно требует циклического изменения температур, поскольку для того, чтобы начался новый цикл, должна произойти денатурация ДНК (при температуре около 95°С) после чего следует отжиг праймеров (чаще всего при температурах от 50 до 60°С) и их удлинение (наиболее часто используются температуры 72-75°С).

На рис.1 показана схема устройства полезной модели, позволяющей с помощью трех независимо управляемых шприцевых насосов и двух проточных микрофлуидных чипов Y- или Т-типа на предметном стекле для микроскопии (или ему подобном), накрытом аналогичного размера стеклом или оргстеклом, разделенных пространством, образуемым рамкой из силиконовой резины подходящей толщины (равной или несколько превышающей диаметр выпускного канала второго проточного микрофлуидного чипа), формировать двойную эмульсию «В-М-В», в которой внутренний водный слой представляет собой множество монокапель, содержащих все необходимые ингредиенты для проведения ПЦР, включая интеркалирующий краситель SYBR Green I или ему подобный, а также анализируемый образец нуклеиновых кислот. Вместо интеркалирующих красителей могут использоваться системы детекции произошедшей амплификации с помощью разнообразных гибридизационных зондов, меченных флуорохромами. Средний (масляный) слой необходим для пространственного разобщения и исключения испарения водных монокапель внутренней фазы, а внешний водный слой представляет собой готовую к полимеризации смесь мономеров полиакриламидного геля, который после завершения заполнения образующегося между стеклами камеры пространства и завершения процесса полимеризации становится гелевым матриксом и выполняет роль фиксатора образцов (монокапель) для последующей детекции в них результатов амплификации, проводимой в подходящем ДНК-термоциклере, рассчитанном на проведение ПЦР в режиме in situ (на предметных стеклах) или в ДНК-термоциклере с полой воздушной камерой, нагреваемой и охлаждаемой мощной лампой и вентилятором соответственно, где возможно пространственно разместить созданный микрофлуидный чип для проведения ПЦР. Среди других особенностей данной полезной модели следует указать необходимость расположения заготовки для микрофлуидного чипа для проведения ПЦР в виде собранной конструкции из стекол и силиконовой рамки с двумя отверстиями в последней (одного впускного. для подачи двойной эмульсии, расположенного в самом нижнем углу конструкции) и одного выпускного для стравливания воздуха, расположенного в противоположном углу верхней части, в вертикально-наклонном положении (для достижения наиболее полного заполнения образуемой стеклами и силиконовым спейсерами полой камеры), а также предобработки стеклянных поверхностей чипа -метакрилоксипропилтриметоксисиланом (или иными силанами, способными к сополимеризации с акриламидными мономерами), позволяющего формировать на стекле реакционноспособные группы, вступающие в реакцию сополимеризации с мономерами полиакриламидного геля и фактически обеспечивающего приклеивание к стеклу внешней фазы двойной эмульсии «В-М-В». После окончания полимеризации геля в микрофлуидном чипе для ПЦР и помещения его в подходящий ДНК-термоциклер в последнем осуществляется термоциклирование, температурные и временные параметры которого зависят от особенностей амплифицируемых фрагментов нуклеиновых кислот, по завершении которой данный чип помещается на столик подходящего флуоресцентного микроскопа, снабженного цифровой фотокамерой, и происходит регистрация свечения флуоресцентного красителя, свидетельствующая о прошедшей амплификации и, следовательно, о наличии искомой последовательности нуклеиновых кислот в конкретных монокаплях, фотодокументирование и оцифровка результатов.

Использованная литература

1. Четверин А.Б., Четверина Е.В. Способ клонирования нуклеиновых кислот // Патент РФ 2, 114, 175. 1998.

2. Четверин А.Б., Четверина Е.В. Способ размножения нуклеиновых кислот, способ их экспрессии и среда для их осуществления // Патент РФ 2,048, 522. 1995.

3. Chetverin A.B., Chetverina E.V. Method for amplification and expression of nucleic acids in solid media and its application for nucleic acids cloning and diagnostics // U.S. Patent No. 5,958,698. 1999.

4. Chetverin A.B., Chetverina E.V. Method for amplification of nucleic acids in solid media // U.S. Patent No. 5.616.478. 1997.

5. Diehl F., Li M., He Y., Kinzler K.W., Vogelstein В., Dressman D. BEAMing: single-molecule PCR on microparticles in water-in-oil emulsions // Nat. Methods. 2006. V. 3. 7. P.551-559.

6. Hindson B.J., Ness K.D., Masquelier D.A., Belgrader P. et al. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number // Anal. Chem. 2011. V.83. P.8604-8610.

7. Leng X., Zhang W., Wang C., Cui L., Yang C.J. Agarose droplet microfluidics for highly parallel and efficient single molecule emulsion PCR // Lab. Chip.2010. V.10. P.2841-2843.

8. Musyanovych A., Mailander V., Landfester K. Miniemulsion droplets as single molecule nanoreactors for polymerase chain reaction // Biomacromolecules. 2005. V. 6.4. P. 1824-28.

9. Nakano M. et al. Single-molecule PCR using water-in-oil emulsion // J. Biotechnol. 2003. V. 102. 2. P.117-124.

10. Pinheiro L.B., Coleman V.A., Hindson C.M., Herrmann J., Hindson B.J., Bhat S., Emslie K.R. Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification // Anal. Chem. 2012. V.84. P.1003-1011.

11. Williams R. et al. Amplification of complex gene libraries by emulsion PCR // Nat. Methods. 2006. V. 3. 7. P. 545-550.

12. Zhu Z., Zhang W., Leng X., Zhang M., Guan Z., Lu J., Yang C.J. Highly sensitive and quantitative detection of rare pathogens through agarose droplet microfluidic emulsion PCR at the single-cell level // Lab. Chip.2012. V.12. P.3907-3913.

1. Устройство для проведения цифровой полимеразной цепной реакции, отличающееся тем, что с помощью двух проточных микрофлуидных чипов и трех шприцевых насосов в чипе для проведения ПЦР создается двойная эмульсия «вода-масло-вода», где полимеризующаяся внешняя водная фаза, выполняющая роль гелевого матрикса, оказывается приклеенной к стеклянным поверхностям чипа, и содержит в фиксированном положении отдельные монокапли внутренней водной фазы, в которую при формировании эмульсии добавлены все необходимые ингредиенты для проведения ПЦР, включая интеркалирующий краситель SYBR Green I или ему подобный, а также анализируемый образец нуклеиновых кислот, причем данные монокапли заключены каждая в масляные оболочки, служащие для их пространственного разобщения и предотвращения испарения в ходе ПЦР, по завершению которой регистрация произошедшей амплификации осуществляется с помощью подходящего флуоресцентного микроскопа, где свечение соответствующего флуоресцентного красителя свидетельствует о наличии искомой последовательности нуклеиновых кислот в конкретных монокаплях.

2. Устройство по п.1, отличающееся тем, что регистрация процесса амплификации нуклеиновых кислот осуществляется с помощью флуоресцентно-меченых гибридизационных зондов.