Устройство для прямой электрохимической регистрации непраймированного синтеза молекул днк на основе pн-чувствительного сенсора

Полезная модель относится к биосенсорным аналитическим устройствам с.областью применения в молекулярной биологии, молекулярной биотехнологии, бионанотехнологиях, медицине, в решении вопросов пищевой промышленности, сельского хозяйства, установления личности, биобезопасности. Устройство выполняет прямую, не использующую меток, регистрацию непраймированного синтеза молекул ДНК, который совершается при одновременном наличии в реакционной среде трех компонентов - ДНК-полимеразы, никазы и дезоксинуклеозидтрифосфатов. Синтез проявляется в эффекте выделения протонов в ходе ферментативной реакции, содержащей указанные компоненты. Устройство может быть использовано для оценки наличия в пробе фермента синтеза ДНК - полимеразы, наличия в пробе дезоксинуклеозидтрифосфатов, а также наличия фермента-индуктора синтеза ДНК никующей эндонуклеазы (никазы). Устройство может быть применено для регистрации (детекции) как непраймированного (неспецифического), так и специфического синтеза молекул ДНК любой природы - клеток теплокровных, клеток микроорганизмов. Устройство может найти применение в области молекулярной биологии, молекулярной диагностики для решения задач фундаментального и прикладного плана.

Полезная модель относится к биосенсорным аналитическим устройствам с областью применения в молекулярной биологии, молекулярной биотехнологии, бионанотехнологиях, медицине, в решении вопросов пищевой промышленности, сельского хозяйства, установления личности, биобезопасности. Устройство выполняет прямую, не использующую меток, регистрацию непраймированного синтеза молекул ДНК, который совершается при одновременном наличии в реакционной среде трех компонентов - ДНК-полимеразы, никазы и дезоксинуклеозидтрифосфатов (дНТФ). Синтез проявляется в эффекте выделения протонов в ходе ферментативной реакции, содержащей указанные компоненты. Устройство может быть использовано для оценки наличия в пробе фермента синтеза ДНК -, полимеразы, наличия в пробе дезоксинуклеозидтрифосфатов, а также наличия фермента-индуктора синтеза ДНК никующей эндонуклеазы (никазы). Устройство может быть применено для регистрации (детекции) как непраймированного (неспецифического), так и специфического синтеза молекул ДНК любой природы - клеток теплокровных, клеток микроорганизмов. Устройство может найти применение в области молекулярной биологии, молекулярной диагностики для решения задач фундаментального и прикладного плана.

Известна безметочная (прямая) детекция синтеза молекул ДНК, в которой не используются специализированные реагенты, называемые метками и обеспечивающие индикацию целевых молекул. Этот подход является новым и интенсивно развивается в последнее время. Методология позволяет значительно упростить и удешевить процесс регистрации синтеза и секвенирования ДНК и способствует ее ускоренному практическому применению в различных целях, и, прежде всего, в диагностических. Впервые безметочная детекция синтеза молекул ДНК на основе электрохимической регистрации процесса была рассмотрена в работе (1). Авторы сформулировали принцип измерения и показали, что процесс синтеза молекулы ДНК можно регистрировать непосредственно с помощью известных в электрохимических измерениях схем, в частности, используя амперометрические измерения. Метод может быть применен как для регистрации ферментативного синтеза ДНК или РНК, так и любой другой биологической реакции, основанной на аналогичных принципах.

Суть безметочного синтеза состоит в следующем. Самопраймированную одноцепочечную молекулу ДНК иммобилизуют на поверхности золотого электрода. Поверхность содержит слой тиолсодержащих молекул, полученный самосборкой. Электрод обрабатывают раствором фрагмента Кленова ДНК-полимеразы. В присутствии комплементарных дезоксинуклеозидтрифосфатов, подаваемых раздельно, возникает переходной электрический сигнал, выраженный током и свидетельствующий о встраивании нуклеотида в молекулу-матрицу. Этот сигнал характеризуется высокой амплитудой (300 пА), возникает практически без задержки, имеет время развития около 50 мс. За первой фазой возникает вторая, характеризующая его дальнейшую трансформацию и названная "спад-подъем" - падение и рост тока. Она наблюдается на временах порядка 300 мс, после чего ко времени 1 с происходит затухание сигнала. Если в некоторый момент времени к электроду подается раствор некомплементарного дНТФ, токовый сигнал не появляется. Также не возникает сигнал в случае, если комплементарный дНТФ подается в отсутствие ДНК полимеразы, в отсутствие ДНК-матрицы, или если ДНК-матрица не находится в иммобилизованном состоянии на поверхности электрода. Отсутствие сигнала в контрольных экспериментах свидетельствует о том, что его возникновение связано только с реакцией, обусловленной присутствием комплементарного нуклеотида и одновременного присутствия ДНК-полимеразы и иммобилизованной ДНК. Встраивание каждого очередного нуклеотида приводит к увеличению общего отрицательного заряда молекулы ДНК на один электрон. Это возникает как результат удаления протона из положения 3'-ОН группы праймерной ДНК в результате каталитической реакции. В силу электронейтральности увеличение общего отрицательного заряда молекулы ДНК компенсируется эквивалентным увеличением общего положительного заряда раствора, который обусловлен выделением протона. Выделившийся протон не связан с молекулой ДНК и с высокой скоростью диффундирует в раствор. В сущности выполненный анализ данного процесса и сделанные выводы свидетельствуют о предложенном новом подходе к выполнению безметочной регистрации реакции синтеза ДНК или, при определенной постановке схемы измерений, о выполнении безметочного секвенирования ДНК (1).

По сути описанного можно отметить следующее. Авторы продемонстрировали принцип прямой безметочной детекции электрического сигнала, основанный на появлении индуцированного заряда в процессе синтеза молекул ДНК, катализируемого ДНК-полимеразой. Молекулы ДНК были иммобилизованы на золотом электроде со специальным покрытием, содержащим клямпирующий напряжение усилитель. Для обозначения этого эффекта в данной системе авторы вводят термин - нарушение зарядового состояния при синтезе молекул ДНК. Концепция измерения нарушенного состояния основана на выполнении принципа электронейтральности и индуцировании поверхностного заряда в неполяризуемом электроде. В результате появления иммобилизованного отрицательного заряда на молекуле ДНК он может быть обнаружен, поскольку положительный заряд (протон) быстро диффундирует из области реакции и этим усиливает эффект поляризации. Данная работа показывает, что секвенирование ДНК может быть реализовано путем безметочной электрохимической регистрации реакций, сопровождающих этот процесс (1).

Известен также подход к регистрации секвенирования молекул ДНК, основанный на использовании полупроводниковых приборов. В последнее время значительно интенсифицировались исследования данного типа (2-4). Значимость направления состоит в важности информации, получаемой при расшифровке последовательности геномной ДНК. Эта информация имеет значение для человека в абсолютном понимании, но вместе с тем имеет и первостепенную важность для таких приложений как биотехнология, медицина. Для ее недорогого и быстрого получения требуется разработка соответствующих недорогих приборов, которые можно было бы выпускать в значительных количествах для практического использования. Отметим основные моменты, связанные с использованием принципов полупроводникового секвенирования ДНК (4). Техника регистрации основана на прямой безметочной детекции. В методике не используются сложные методы, связанные с применением оптических меток. Данные секвенирования получаются путем прямого считывания последовательности, которое основано на регистрации выброса ионов (протонов) в ходе ДНК-полимеразной реакции. В реакции используются немодифицированные нуклеотиды, результаты реакции регистрируются в режиме параллельного считывания. Одиночный считывающий элемент представляет собой ион-чувствительный (pH-чувствительный) полевой транзистор. Общее число считывающих элементов составляет 1.2 миллиона. Каждый такая ячейка (или считывающий элемент), обеспечивает возможность производить параллельное считывание результатов независимых реакций. Показана эффективность данной системы при секвенировании трех бактериальных геномов и генома человека (4).

Особенности нового направления геномного секвенирования состоят в использования для этой цели микроэлектронной технологии регистрации, основанной на применении КМОП-датчиков (КМОП - комплементарные "металл-окисел-полупроводник" датчики) (2, 3). Для регистрации процесса секвенирования предложили применять мультисенсорную систему, содержащую 1.2 миллиона одиночных сенсоров. Каждый сенсор представляет полевой транзистор, регистрирующий изменение pH раствора. Принцип секвенатора основан на том, что в цикле присоединения нуклеотида к однонитевой ДНК-матрице, являющейся фрагментом целой молекулы ДНК, происходит закисление среды, связанное с выбросом протона, которое регистрируется полевым транзистором. Синтез осуществляется ДНК-полимеразой. Однонитевая ДНК иммобилизована на затворе полевого транзистора. На каждом транзисторе иммобилизован свой клон ДНК. Суммированный по многим клонам такой сигнал представляет значительную величину, характеризующуюся высоким отношением "сигнал/шум" и может быть надежно зарегистрирован каждым транзистором, входящим в состав измерительной ячейки. Поскольку выброс протона связан с нуклеотидами, которые подаются в заданной последовательности, прибор производит построение картины выброса протонов по всему набору сенсоров. Полученные данные поступают на цифровую обработку. Данная система представляется альтернативой оптической, в которой для генерации сигнала каждый присоединенный нуклеотид снабжен оптической флюоресцирующей меткой. Несмотря на то, что существует значительное число различных электрохимических систем для регистрации протонов, в качестве считывающего элемента, который также можно назвать первичным датчиком, выбран полевой транзистор. Это связано с его высокими характеристиками по химической чувствительности при регистрации концентрации протонов и его технологическом сочетании с КМОП-технологией.

Для выполнения секвенирования используется лунка диаметром 3.5 мкм, которая окружена стенкой высотой 3 мкм из диэлектрического материала. В качестве ион-селективного материала использован диэлектрик, выполненный из пятиокиси тантала (Ta₂O₅). Сенсорный элемент обладает высокой химической чувствительностью к протонам, составляющей 58 мВ/pH. Сенсор, сопряженный с обрабатывающей электроникой, обеспечивает прямое преобразование сигнала, возникающего в биологическом материале, в электронный сигнал. В противоположность оптическому считыванию в данном подходе не применяется накопление фотонов с целью усиления сигналов (4).

Известны два типа синтеза двухцепочечной ДНК - специфический, происходящий на основе одноцепочечной матрицы ДНК, и, условно неспецифический или непраймированный - осуществляющийся в отсутствии матрицы и праймера. Известно, что для начала специфического синтеза ДНК-полимеразами необходимы матричная нить и праймер - короткий олигонуклеотид со свободным 3'-ОН концом, комплементарный участку матричной цепи. После выделения ДНК-полимеразы IЕ. coli было обнаружено, что частично очищенные препараты этого фермента могут синтезировать длинные сополимеры дезоксиаденозинтрифосфат+дезокситимидинтрифосфат без добавления праймеров и матрицы. В настоящее время этому синтезу, названному синтезом de novo или непраймированным синтезом ДНК, уделяется значительное внимание исследователей. При детальном анализе эффекта было обнаружено, что термофильные ДНК-полимеразы синтезируют высокомолекулярную ДНК из дезоксинуклеозидтрифосфатов в отсутствии любой инициирующей нуклеиновой кислоты (5, 6). Было исключено возможное влияние примесей нуклеиновых кислот, которые могли бы служить матрицей/праймером в реакции синтеза. Нашли, что при таком синтезе последовательности синтезированной ДНК были представлены тандемными повторами, подобными (CTAGATAT)n или (AGATATCT)n. Подобные повторяющиеся последовательности ДНК широко распространены в природе, например в сателлитной ДНК, а также в кодирующих участках генома эукариот. Этот, синтез называют «креативным» или синтезом ДНК de novo (также синтезом ДНК ab initio) и высказывается предположение, что генетическая информация потенциально может создаваться непосредственно белком. При анализе параметров синтеза ДНК, независимого от матрицы и праймера, было также показано, что достаточно медленный «креативный» синтез ДНК значительно стимулируется при добавлении эндонуклеаз рестрикции в реакционную смесь с ДНК-полимеразой (7, 8). Обнаруженный синтез в присутствии эндонуклеаз рестрикции характеризуется коротким лаг-периодом. После лаг-периода синтез ДНК переходит в линейный режим и заканчивается за 1-2 часа. За это время используются практически все дезоксинуклеозидтрифосфаты, введенные в реакционную среду. Стимуляция синтеза ДНК, независимого от матрицы и праймера, зарегистрирована в присутствии никующих эндонуклеаз (9). Для регистрации неспецифического/непраймированного синтеза молекул ДНК используется техника электрофореза в агарозном геле.

Имеющиеся данные свидетельствуют о том, что для регистрации неспецифического синтеза молекул ДНК может быть использован прямой метод электрохимической детекции с применением полупроводниковых pH-чувствительных полевых транзисторов. Несмотря на рассмотренные способы детекции синтеза (1) и секвенирования (4) ДНК, данный способ не был описан до настоящего времени в применении к непраймированному синтезу ДНК с использованием pH-чувствительных полевых транзисторов.

Задача, на решение которой направлена заявляемая полезная модель, состоит в создании устройства на основе pH-чувствительного полевого транзистора для выполнения прямой электрохимической регистрации непраймированного синтеза молекул ДНК. На Фигуре 1 представлена схематически конструкция измерительной системы. Приняты следующие обозначения: 1 - полевой транзистор, 2 - pH-чувствительный затвор полевого транзистора, изготовленный из нитрида кремния, 3 - измерительная кювета полевого транзистора объемом 5 мкл, 4 - измеряемый раствор, 5 - электрод сравнения (Ag/AgCl/KCl), 6 - устройство для задания условий измерения полевым транзистором (напряжения питания и смещения), 7 - устройство регистрации выходного сигнала полевого транзистора (XY -регистратор, компьютер).

Технический результат, который получается при использовании предлагаемой полезной модели, заключается в том, что данное устройство обеспечивает быстрое определение завершенной реакции синтеза ДНК (время измерения составляет величину порядка 60-120 с), для измерения используется малое количество дорогостоящей реакционной смеси (порядка 3-5 микролитров), использует простое, недорогостоящее оборудование, обеспечивающее измерение рН полевым транзистором.

В измерениях использовали дезоксинуклеозидтрифосфаты и ферменты - никующую эндонуклеазу (никазу) и ДНК-полимеразу. Детекция синтеза ДНК состояла в регистрации изменения pH раствора (его закисления) с помощью pH-чувствительного полевого транзистора. В условия измерения входило использование гомогенных растворов всех реактивов.

В измерениях использовали полевые транзисторы с затворным диэлектриком из нитрида кремния (Si₃N₄). Типичные вольт-амперные характеристики (ВАХ) для транзистора с Si₃N₄ представлены на Фигуре 2. Показаны вольт-амперные характеристики для полевого транзистора, полученные в буферных средах с pH 2.0, 7.0 и 10.0. ВАХ. Видно, что изменение pH растворов вызывает изменение тока транзистора и, следовательно, его выходного сигнала. На Фигуре 2 представлена зависимость тока стока транзистора от потенциала затвора в буферных растворах с различным значением pH (1 - pH 2.0, 2 - pH 7.0, 3 - pH 10.0). Условия измерения: напряжение стока равно 0.3 В; чувствительность по оси Y=100 мВ/см, по оси X=100 мВ/см, pH чувствительный диэлектрик - Si₃N₄.

Измерения позволили оценить величину pH-чувствительности, которая составляла для данного транзистора величину 56 мВ/pH. Максимальная крутизна вольт-амперной характеристики составляла 0.105 мкА/мВ. Рассчитанная чувствительность по току составляла 3.4 мкА/pH. Характеристики сняты при напряжении затвора, равном 600 мВ.

Измерения с использованием биологического материала выполняли в сформированной микрокювете транзистора, объем которой составлял 5 мкл. Последовательность действий заключалась в измерении pH раствора до начала реакции, за которым следовало измерение pH раствора после завершения реакции. Внесение растворов в кювету pH-чувствительного полевого транзистора осуществляли с помощью автоматической пипетки. В качестве измерительной среды использовали 150 мМ раствор NaCl, содержащий 1 мМ MgCl ₂, pH 8.0. Буферную компоненту не применяли. В качестве биологических компонент использовали большой фрагмент ДНК-полимеразы Bst и никазу Nt.BspD6I. Этот белок (70.8 кДа) узнает на двухспиральной ДНК сайт 5'-GAGTC-3'/5'-GACTC-3' и расщепляет только цепь, содержащую последовательность GAGTC на расстоянии 4 п.н. от сайта узнавания в сторону 3' - конца (никаза Nt.BspD6I выделена и очищена авторами, ДНК-полимераза Bst закуплена у фирмы New England Biolabs (США), дНТФ закуплены у фирмы Fermentas, Литва). Эксперимент состоял из двух этапов. На первом производили синтез ДНК в среде объемом 30 мкл, содержащей 150 мМ NaCl, 150 мкМ дНТФ, никазу (5 единиц активности) и ДНК-полимеразу Bst (2 единицы активности). Продолжительность синтеза составляла 60 мин, температура реакционной среды была равна 55°C, что представлялось оптимальным для хода реакции. На втором этапе производили оценку величины pH раствора, полученного в ходе выполнения реакции, в сравнении с pH раствора, не содержащего ДНК-полимеразу и не подвергавшегося нагреванию, в котором не происходило реакции. Методом контроля завершенности реакции синтеза являлась оценка присутствия высокомолекулярных продуктов электрофорезом в 1% агарозном геле.

Растворы, для которых проводился мониторинг изменений pH, были представлены следующим рядом (см. Таблицу 1).

Таблица 1
Типы исследуемых растворов
пробы	Состав проб	Примечание: цель измерения pH растворов
1	150 мМ NaCl	контроль исходного значения pH
2	150 мМ NaCl+дНТФ (150 мкМ)	оценка роли дНТФ в сдвиге pH до прохождения реакции
3	150 мМ NaCl+дНТФ+никаза	оценка pH в случае отсутствия синтеза ДНК без ДНК-полимеразы
4	150 мМ NaCl+дНТФ+никаза+ДНК-полимераза	определение эффекта - конечного значения pH и величины его изменения

На Фигуре 3 приведен типичный пример изменения pH растворов в ходе эксперимента. Закисление среды (горизонтальная ось, позиция 4) достигается в результате синтеза ДНК с помощью набора ферментов - никазы и ДНК-полимеразы. Обозначения: вертикальная ось - величина pH раствора, горизонтальная - номер пробы; 1 - солевой раствор, 150 мМ NaCl, pH 7.2; 2 - добавлены дНТФ, pH 6.75; 3 - добавлена никаза, но не выполнены условия для проведения реакции синтеза из-за отсутствия ДНК-полимеразы, pH 6.68, рН=0.07; 4 - добавлена ДНК-полимераза, проведена полная реакция, pH=5.31, рН=1.4.

Показали, что реакция неспецифического синтеза ДНК приводит к сдвигу pH в кислую область (см. Фигуру 3). Подтверждающим фактом синтеза в процессе реакции высокомолекулярных продуктов являлся электрофорез в агарозном геле. На Фигуре 4 показаны результаты выявления безматричного/безпраймерного синтез ДНК (синтез ДНК de novo) в присутствии никующей эндонуклеазы Nt.BspD6I. Показаны результаты электрофореза в 1% агарозном геле. Использованы следующие обозначения: 1-150 мМ NaCl+150 мкМ дНТФ+2 единицы активности ДНК-полимеразы; 2-150 мМ NaCl+150 мкМ дНТФ+2 единицы активности ДНК-полимеразы+5 единиц активности никазы; М - маркер длин ДНК.

При выбранных условиях измерения среднее значение сдвига pH оценивается как величина в 1.5 единицы при ошибке измерений порядка 20%. Присутствие в реакционной среде только никазы не приводит к формированию ни низко (двухцепочечные молекулы ДНК с малым числом пар оснований, менее 200), ни высокомолекулярных (двухцепочечные молекулы ДНК с высоким числом пар оснований, более 1000) продуктов реакции.

В заключение отметим основные результаты, полученные при использовании полезной модели:

- показали, что непраймированный синтез ДНК, протекающий в безбуферном растворе, сопровождается закислением среды - сдвигом pH раствора, содержащего полученную ДНК, в область низких значений;

- сдвиг pH можно регистрировать в условиях, отличающихся от описанных в работе (1), т.е. представляет новые условия измерения, а именно, использует неиммобилизованные реагенты;

- использование pH-чувствительного полевого транзистора позволяет выполнять измерения в малых объемах, снижая непроизводительные затраты на реактивы;

Таким образом, показано, что результат реакции непраймированного синтеза молекул ДНК можно зарегистрировать с помощью прямой электрохимической регистрации, а именно при использовании - pH-чувствительного полевого транзистора.

Список цитированной литературы

1. Pourmand, N., М. Karhanek, et al. (2006). "Direct electrical detection of DNA synthesis." Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 103 (17): 6466-6470.

2. Rothberg, J.M., W.Hinz, et al. (2009). Methods and apparatus for measuring analytes using large scale FET arrays. US Patent 20090127589 A1.

3. Rothberg, J.M., W.Hinz, et al. (2011). "An integrated semiconductor device enabling non-optical genome sequencing." Nature 475 (7356): 348-352.

4. Rothberg, J.M., J.C.Schultz, et al. (2010). Integrated sensor arrays for biological and chemical analysis. US Patent, International Publication Number WO 2010/047804 A1.

5. Ogata, N. and T.Miura (1997). "Genetic information 'created' by archaebacterial DNA polymerase." Biochem. J.324: 667-671.

6. Ogata, N. and T.Miura (1998). "Genetic information 'created' by DNA polymerase the archaeon Thermococcus litoralis: influences of temperature and ionic strength." Nucleic Acids Res. 26: 4652-4656.

7. Liang, X., K.Jensen, et al. (2004). "Very efficient template/primer-independent DNA synthesis by thermophilic DNA polymerase in the presence of a thermophilic restriction endonuclease." Biochemistry 43: 13459-13466.

8. Liang, X., B.C.-Y. Li, et al. (2006). "Ab initio DNA synthesis by endonuclease." Nucleic Acids Res. 50: 95-96.

9. Zyrina, N.V., L.A.Zheleznaya, et al. (2007). "N.BspD6I DNA nickase synthesis of non-palindromic repetitive DNA by Bst DNA polymerase." Biol. Chem. 388: 367-372.

Устройство для прямой безметочной электрохимической регистрации непраймированного синтеза молекул ДНК, включающее рН-чувствительный полевой транзистор, содержащий встроенную микрокювету для размещения измеряемых реагентов и выполненную с возможностью подачи в нее растворов до и после осуществления реакции синтеза, протекающей при наличии ДНК-полимеразы, никующей эндонуклеазы и дезоксинуклеозидтрифосфатов, и разъем для подключения pH-чувствительного полевого транзистора в измерительную цепь.