Днк-чип для комплексной идентификации условно-патогенных возбудителей урогенитальных инфекционных заболеваний

Полезная модель относится к медицине, а именно к дерматовенерологии и представляет собой ДНК-чип для комплексной идентификации условно-патогенных возбудителей урогенитальных инфекционных заболеваний, позволяющий осуществлять параллельную идентификацию в полученном от пациента биоматериале 21-го микроорганизма: условно-патогенных (Peptostreptococcus anaerobius, Prevotella melanogenica, Gardnerella vaginalis, Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum, Fusobacterium nucleatun, Bacteroides flagilis, Prevotella oralis, Anaerococcus prevotii, Mobilincus mulieris, Mobilincus curtisii, Bacteroides vulgatus, Staphylococcus epidermidis, Esherichia coli, Enterococcus fecalis, Corynebacterium spp, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae, Klebsielle oxytoca, Streptococcus sanguinis); непатогенных (Lactobacillus spp.).

Диагностика осуществляется путем одновременной идентификации микроорганизмов в биологическом образце, полученном от пациента с урогенитальными инфекционными заболеваниями, с помощью олигонуклеотидных зондов, специфичных к каждому из выбранных возбудителей, иммобилизованных на стеклянных слайдах с эпокси-модифицированной поверхностью (формат ДНК-чипа).

Способ предусматривает сканирование слайдов на многоканальном сканере биочипов, обработку результатов в автоматическом режиме с использованием программы, осуществляющей перевод флуоресцентных сигналов в цифровые показатели, выдачу качественных результатов исследования, при этом положительный результат свидетельствует о наличии соответствующего микроорганизма в испытуемом биообразце, а отрицательный результат свидетельствует об отсутствии соответствующего микроорганизма в испытуемом биообразце.

Параллельная идентификация в биологическом образце от пациента с урогенитальными инфекционными заболеваниями 21-го условно-патогенного и непатогенного микроорганизма позволяет осуществить исследование в едином формате, повысить точность идентификации условно-патогенных возбудителей ИППП за счет расширения их спектра и оценить состояние микробиоценоза мочеполовой сферы пациентов.

Область техники настоящей полезной модели

Настоящая полезная модель относится к области медицины, в частности, к диагностике урогенитальных инфекционных заболеваний.

Предшествующий уровень техники настоящей полезной модели

Урогенитальные инфекции наносят существенный вред организму человека, т.к. нередко являются причиной развития патологии репродуктивной системы вплоть до бесплодия. Современными исследователями [Воронова О.А., Герасимова Н.М., Вишневская И.Ф., Кобенко Э.Г. Клинико-эпидемиологические особенности хронического аэробного вагинита. Актуальные вопросы терапии инфекций, передаваемых половым путем, и дерматозов. - Екатеринбург, 2002; 58-59; Кира Е.Ф. Бактериальный вагиноз. Спб.: ООО «Нева-Люкс», 2001; 364] отмечается, что патологические состояния мочеполового тракта чаще всего носят полимикробный характер и связаны с участием в воспалительном процессе ассоциаций условно-патогенных микроорганизмов. Степень дисбиоза микрофлоры урогенитального тракта может быть различной и касаться как видового состава ассоциантов, так и числа представителей отдельного вида. Нарушения количественного и видового состава среды мочеполового тракта нередко приводят к клиническим проявлениям инфекционного процесса (уретрит, вагиноз, вагинит). Известно также, что рост колоний условно - патогенной микрофлоры (чаще - Staphylococcus spp., Streptococcus spp; колиформных бактерий и др.) значительно повышает риск возникновения гнойно-воспалительных заболеваний органов малого таза, приводящих к развитию хориоамнионита, интраамниальной инфекции, послеродового эндометрита, послеоперационных воспалительных осложнений [Анкирская А.С. Микроэкология влагалища и профилактика акушерской патологии. - Инфекции и антимикробная терапия. - 1999. - 3; Hiller S.L., Kiviat N.B., Hawes S.E. et.al. Role of bacterial vaginosis associated macroorganisms in endometritis. -/ Am.J. Obstet. Gynecol. - 1996.; Watts D.H., Krohn M.A., Heller S.L. et.al. Bacterial vaginosis as a risk factor postcesarean endomrtritis // Obstet. Gynecol. - 1990].

Как правило, при неспецифических воспалительных заболеваниях возникает увеличение численности и расширение спектра условно-патогенной аэробной флоры, колонизирующей слизистые оболочки наружных половых органов. По данным большинства исследователей, наиболее частой причиной неспецифических воспалительных процессов мочеполовой системы является кокковая и палочковая микрофлора {Streptococcus spp., Staphylococcus spp., Micrococcus, Pneumococcus, E.coli, Proteus, H. influenzae, представители семейства Enterobacteriacae и/или рода коринебактерий). В 3-19% наблюдений при неспецифических уретритах и вульвовагинитах в культуре выделяют представителей группы Streptococcus: Str. -, -haemolyticum, Str. pyogenus. В значительном числе наблюдений (10-46,2%) неспецифические воспалительные процессы обусловлены колонизацией слизистых оболочек уретры, вульвы и влагалища представителями семейства Enterobacteriaceae (E.coli, Klebsiella spp., Citrobacter spp., Enterobacter spp., и др.) [Никонов А.П., Асцатурова О.Р. Вульвовагиниты: в помощь практикующему врачу. - Гинекология (журнал для практикующих врачей). - 2002. - Том.4. - 3.; Коршунов В.М. Володин Н.Н. Ефимов Б.А. и др. Микроэкология влагалища. Коррекция микрофлоры при вагинальных дисбактериозах. - Учебное пособие. М.: ВУНМУ МЗ РФ. - 1999. - 80 с.; Уварова Е.В., Султанова Ф.Ш. Влагалище как микроэкосистема в норме и при воспалительных процессах гениталий различной этиологии (обзор литературы) - Гинекология. - 2003. - Том 4. - 4. - с.189-195.; Donders G.G., Vereecren A., Bosmans E. et. al. Aerobic vaginitis is an entity with abnormal vaginal flora that is distinct from bacterial vaginosis. - Jnt.J.STD.AIDS. - 2001; 2 supp.].

Согласно данным современных исследователей, более чем у 40% больных с воспалительными заболеваниями урогенитальной системы выявляются генитальные микоплазмы, при этом наибольшее клиническое значение имеют 3 представителя класса Mollicutes (микоплазм): Mycoplasma genitalium, Ureaplasma urealyticum, Mycoplasma hominis. Частота обнаружения Ureaplasma urealyticum и Mycoplasma hominis широко варьирует в различных популяционных группах, составляя от 10% до 50% (по данным ряда авторов, - до 80%) [Yokoi S., Maeda S., Kubota Y., Tamaki М., Mizutani K., Yasuda М., et The role of Mycoplasma genitalium and Ureaplasma urealyticum biovar 2 in postgonococcal urethritis. Clin Infect Dis 2007; 45(7): 866-71; Taylor-Robinson D. The role of Ureaplasma urealyticum. Int J STD AIDS 1998; 9:2:123-124]. Уреаплазмы и Mycoplasma hominis нередко выявляются у клинически здоровых лиц, и, являясь условно-патогенными микроорганизмами, могут в норме колонизировать органы урогенитальной системы. Однако при определенных условиях эти микроорганизмы способны потенцировать развитие воспалительных процессов мочеполового тракта. Несмотря на неоднозначность мнений исследователей в отношении патогенной роли Ureaplasma urealyticum и Mycoplasma hominis, в этиологической классификации Всемирной организации здравоохранения (2006 г.) и синдромальной классификации Centers for Disease Control and Prevention эти микроорганизмы выделены как возможные этиологические агенты неспецифических негонококковых уретритов, воспалительных заболеваний органов малого таза и бактериального вагиноза.

По данным мировой статистики среди инфекций влагалища одно из первых мест принадлежит бактериальному вагинозу (БВ), частота выявляемости которого, по разным источникам, колеблется от 12% до 80% и зависит от контингента обследованных женщин. Так, в группах планирования семьи она составляет 17-19%, среди лиц, обратившихся в клиники ИППП - 24-37%, у беременных - 15-37%, а у пациенток с жалобами на патологические выделения из половых путей частота достигает 87% [Amsel R., Totten P.A., Spiegel C.A., Chen K.S. et al. Nonspecific vaginitis: diagnostic criteria and microbial and epidemiologic associations. - Am. J. Med. - 2000, 74, 14-22; Chapin-Robertson К. Use of molecular diagnostics in sexually transmitted diseases. Critical assessment. - Diagn. Microbiol. Infect. Dis. - 1998 Feb; 16(2): 173-84. Review.; Hillier S.L., Holmes K.K. Bacterial vaginosis. - In: Holmes K.K., Mardh P.A., Sparling P.F., Wiesener P.J. eds. Sexually transmitted diseases. 2nd. New York: McGraw-Hill. 1999, 547-560; Mead P.B. Epidemiology of bacterial vaginosis. - Am. J. Obstet. Gynecology. - 2001, 169: 2, 446-449]. Клинически бактериальный вагиноз проявляется длительными, обильными выделениями из половых путей, часто с неприятным запахом, что значительно снижает качество жизни пациентки, а постоянное присутствие в высоких концентрациях условно-патогенных микроорганизмов в нижних отделах половых органов является фактором риска в развитии осложнений беременности и воспалительных заболеваний органов малого таза. Кроме того, при заболевании создаются благоприятные условия для вовлечения в инфекционный процесс возбудителей ИППП. К настоящему времени достаточно хорошо изучен характер нарушений микрофлоры влагалища при БВ и спектр так называемых БВ-ассоциированных микроорганизмов. Первичным проявлением данного заболевания является резкое снижение количества лактофлоры вплоть до полного ее исчезновения, а оставшиеся лактобактерии присутствуют в небольших титрах, и, как правило, анаэробного происхождения, не способны продуцировать перекись водорода. Уровень облигатных анаэробов повышается в 1000 раз, при этом общее количество микроорганизмов во влагалище достигает 10¹⁰-10¹¹ КОЕ/мл отделяемого. Среди бактероидов, которые обнаруживаются у 53-97% больных БВ, чаще всего выделяют виды: B.bivis, B.disiens и группу B.melaninogenicus. Другие виды бактероидов встречаются значительно реже. Грамположительные кокки выявляются у 29-95% женщин с БВ, чаще других выделяют виды P.anaerobis, P.prevotii, P.tetradius и P.asacharolyticus. Значительно реже обнаруживаются Propionibacterium spp, Clostridium ramosum, Veilonella parvula и Fusobacterium spp. Суммарная концентрация их, как правило, превышает 10⁹ КОЕ/мл. Подвижные вибрионоподобные бактерии рода Mobiluncus, которые, как и Gardnerella vaginalis, одно время некоторые авторы считали единственными возбудителями бактериального вагиноза, обнаруживают у 8-85% больных БВ всегда в очень высоком титре (10¹⁰ КОЕ/мл и более). Увеличивается также количество микроаэрофилов (G.vaginalis, M.hominis, U.urealyticum) и факультативно-анаэробных микроорганизмов (S.agalactiae, S.epidermidis, S.faecalis) [James N. Parker and Philip M. Parker. Bacterial Vaginosis: Medical Dictionary, Bibliography & Annotated Research Guide to Internet References Icon Health Publications, 2003 г.; Sumati АН, Saritha NK. Bacterial vaginosis with special reference to anaerobes. - Indian J Pathol Microbiol. 2009 Jan-Mar; 52(1):56-8.].

Ведущую роль в диагностике инфекционной патологии мочеполовой системы играют микробиологические методы, такие как бактериоскопия и культуральное исследование. Данные методы позволяют осуществлять прямое определение возбудителя, изучать фенотипические свойства микроорганизмов, а также чувствительность возбудителей к антимикробным препаратам. Однако для проведения адекватного бактериологического исследования на условно-патогенные микроорганизмы (в частности, анаэробы и микроаэрофилы) необходимо наличие специальных питательных сред и создание определенных условий инкубации. Несмотря на достигнутые успехи в области культивирования Gardnerella vaginalis, Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum и Mobiluncus spp., их идентификация в клиническом материале остается сложной процедурой, требующей длительного времени и опыта.

Соблюдение всех требований, предъявляемых к условиям культивирования анаэробной и микроаэрофильной флоры, к которой относятся условно-патогенные микроорганизмы часто оказывается невозможным не только для рядовых бактериологических лабораторий, но даже и в хорошо оснащенных клинико-диагностических центрах [Keane FE, Maw R, Pritchard С, Ison CA. Methods employed by genitourinary medicine clinics in the United Kingdom to diagnose bacterial vaginosis. Sex Transm Infect. 2005 Apr; 81(2):155-7; Vagoras A, Butylkina R, Juseviciute V, Hallén A, Unemo M, Domeika M. Diagnosis of non-viral sexually transmitted infections in Lithuania and international recommendations. Euro Surveill. 2006 Jul; 11(7):161-4; Hallén A, Påhlson C, Forsum U. Bacterial vaginosis in women attending STD clinic: diagnostic criteria and prevalence of Mobiluncus spp. Genitourin Med. 1987 Dec; 63(6):386-9; Amsel R, Totten PA, Spiegel CA, Chen КС, Eschenbach D, Holmes KK. Nonspecific vaginitis. Diagnostic criteria and microbial and epidemiologic associations. Am J Med. 1983 Jan; 74(1):14-22; Eschenbach DA, Hillier S, Critchlow C, Stevens C, DeRouen T, Holmes KK. Diagnosis and clinical manifestations of bacterial vaginosis. Am J Obstet Gynecol. 1988 Apr; 158(4):819-28; Forsum U, Jakobsson T, Larsson PG, Schmidt H, Beverly A, Bjørnerem A, Carlsson B, Csango P, Donders G, Hay P, Ison C, Keane F, McDonald H, Moi H, Platz-Christensen JJ, Schwebke J. An international study of the interobserver variation between interpretations of vaginal smear criteria of bacterial vaginosis. APMIS. 2002 Nov; 110(11):811-8; Ferris MJ, Masztal A, Aldridge KE, Fortenberry JD, Fidel PL Jr, Martin DH. Association of Atopobium vaginae, a recently described metronidazole resistant anaerobe, with bacterial vaginosis. BMC Infect Dis. 2004 Feb 13; 4: 5; redricks DN, Fiedler TL, Marrazzo JM. Molecular identification of bacteria associated with bacterial vaginosis. N Engl J Med. 2005 Nov 3; 353(18):1899-911].

Стандартным методом для идентификации М. hominis и U. urealyticum считается культуральный метод. Однако метод культивирования требует высокой профессиональной подготовки персонала клинической лаборатории, больших затрат денежных средств и, что не менее важно, занимает от 2 до 5 дней. Еще одним недостатком культурального метода является то, что уреаплазмы очень требовательны к условиям среды. Все это привело к тому, что многие лаборатории отказались от использования культурального метода для идентификации уреаплазм [Cassell G.H., Waites К.В., Watson H.L., Crouse D.Т., and Harasawa R., Ureaplasma urealyticum Intrauterine Infection: Role in Prematurity and Disease in Newborns, Clinical Microbiology Reviews, 1993, Vol.6, p.69-87].

Отмеченные недостатки микробиологических методов идентификации условно-патогенных микроорганизмов потребовали поиска новых подходов, которые позволили бы исключить из анализа стадию культивирования микроорганизмов и осуществлять их одновременную идентификацию в одной пробе биологического материала и, таким образом, сократить время и затраты на обследование пациентов, оценивать состояние микробиоценоза урогенитального тракта.

Одним из перспективных подходов к диагностике неспецифических воспалительных процессов мочеполовой системы является идентификация условно-патогенных микроорганизмов на ДНК-чипе, содержащем иммобилизованные на поверхности олигонуклеотидные зонды, специфичные к определяемым микроорганизмам. Преимуществами использования ДНК-чипов для идентификации условно-патогенных микроорганизмов является:

- возможность одновременной идентификации большого числа условно-патогенных микроорганизмов в биологическом материале за короткое время;

- сокращение себестоимости исследования в сравнении с себестоимостью комплексной идентификации условно-патогенных и непатогенных микроорганизмов с применением микробиологических методов;

- возможность оценивать состояние микробиоценоза урогенитального тракта путем изучения качественного состава флоры урогенитального тракта и соотношения условно-патогенных и непатогенных микроорганизмов, в норме колонизирующих урогенитальных тракт

Применение ДНК-чипа для комплексной идентификации условно-патогенных и непатогенных микроорганизмов может быть полезным в лабораториях, использующих для идентификации условно патогенной микрофлоры только рутинные микробиологические методы, в особенности при отсутствии в этих учреждениях хорошо налаженной культуральной диагностики.

Раскрытие настоящей полезной модели

Сущность настоящей полезной модели заключается в едином формате исследования, позволяющем в короткие сроки в полученном от пациента биологическом материале одновременно идентифицировать 21 микроорганизм, в том числе: условно-патогенные (Peptostreptococcus anaerobius, Prevotella melanogenica, Gardnerella vaginalis, Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum, Fusobacterium nucleatun, Bacteroides flagilis, Prevotella oralis, Anaerococcus prevotii, Mobilincus mulieris, Mobilincus curtisii, Bacteroides vulgatus, Staphylococcus epidermidis, Esherichia coli, Enterococcus fecalis, Corynebacterium spp, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae, Klebsielle oxytoca, Streptococcus sanguinis) и непатогенные микроорганизмы (Lactobacillus spp), что дает возможность оценить состояние микробиоценоза мочеполовой сферы у пациентов с воспалительными заболеваниями урогенитальной системы и повысить точность диагностики урогенитальных инфекционных заболеваний за счет расширения спектра определяемых условно-патогенных и непатогенных возбудителей.

Способ предусматривает следующие стадии:

а) получение испытуемого образца биоматериала от пациента с воспалительными заболеваниями мочеполовой системы,

б) выделение ДНК из испытуемого образца биоматериала стандартным способом.

в) амплификация генов-мишеней в испытуемом образце ДНК, полученном на стадии б), методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с одновременным введением в состав продуктов амплификации олигонуклеотида, меченого флуорофором Су5 (Су5-dCTP). Последовательности праймеров даны в таблице 1.

г) проведение реакции гибридизации путем инкубации меченных флуорофором Су5 продуктов амплификации, полученных на стадии в), на ДНК-чипе, представляющем собой микроскопный слайд с эпокси-модифицированной поверхностью с иммобилизованными на нем олигонуклеотидными зондами, специфичными к каждому из определяемых микроорганизмов,

д) отмывка ДНК-чипа после окончания реакции гибридизации, проведенной в г) и высушивание чипа,

е) регистрация результатов гибридизации с помощью многоканального сканера биочипов;

ж) анализ полученных результатов сканирования с помощью программ, осуществляющих перевод флуоресцентных сигналов в цифровые коэффициенты.

Для детекции указанного 21-го микроорганизма в качестве гена-мишени в пункте в) используют ген 16S РНК (последовательности праймеров даны в таблице 1)

В качестве положительного контроля гибридизации используют меченый продукт амплификации фрагмента генома фага , который гибридизуется с комплиментарным ему олигонуклеотидным зондом на микрочипе. В качестве отрицательного контроля проводят гибридизацию того же продукта с олигонуклеотидным зондом, содержащим 3 однонуклеотидных несовпадения в последовательности. В положительном контроле виден яркий сигнал, в то время как в отрицательном контроле сигнал должен быть на фоновом уровне.

Характеристика генов-мишеней микроорганизмов, праймеров для их амплификации и условий постановки ПЦР, представлены в таблице 1.

Таблица 1.
Гены-мишени, использованные для амплификации выбранного спектра микроорганизмов, праймеры для их амплификации и условия постановки ПЦР
	Ген-мишень	Название праймера	Последовательность 5'-3'	Условия амплификации
1	16S ДНК	BAC-F	gactcctacgggaggcagcagt
2	BAC-R	cgtattaccgcggctgctggca	29 циклов
3	BAC2-F	gtgccagcagccgcggtaatacg	95°C - 15 сек
4	BAC2-R	tcacaacacgagctgacgac	68°C - 8 сек
5	lambda-F	ggtgaaattgccagtattct	72°C - 15 сек
6	lambda-R	cgggagatagtaattagcat
Примечание: праймеры BAC-F и BAC-R для Peptostreptococcus anaerobius, Prevotella melanogenica, Lactobacillus spp, Gardnerella vaginalis, Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum, Fusobacterium nucleatun, Bacteroides flagilis, Prevotella oralis, Anaerococcus prevotii, Mobilincus mulieris, BAC2-F и BAC2-R для Mobilincus curtisii, Bacteroides vulgatus, Staphylococcus epidermidis, Esherichia coli, Enterococcus fecalis, Corynebacterium spp, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae, Klebsielle oxytoca, Streptococcus sanguinis

ДНК-чип, на котором на стадии г) проводят реакцию гибридизации, содержит 12 ограниченных областей, каждая из которых включает 46 спотов (21 иммобилизованный зонд, соответствующий выбранным микроорганизмам, один зонд для ДНК фага и один отрицательный контроль в 2-х повторах по вертикали, см. рис.1 и таб.2). Одна ограниченная область предназначается для постановки одного анализируемого образца ДНК-пробы.

Схема расположения олигонуклеотидных зондов на одной ограниченной области ДНК-чипа представлена в таблице 2.

Таблица 2.
Схема расположения олигонуклеотидных зондов на одном ограниченной области ДНК-чипа
РЕРТ. AN.	P.MEL	LACT spp	G.VAG	M.HOM	KL.OX
РЕРТ. AN.	P.MEL	LACT spp	G.VAG	M.HOM	KL.OX
P.MIR	F.NUCL	B.FLAG	P.ORAL	A.PREV	E.COLI
P.MIR	F.NUCL	B.FLAG	P.ORAL	A.PREV	E.COLI
KL.PN	МОВ.М	МОВ.С	B.VULG	ST.EP	ST.SAN
KL.PN	МОВ.М	MOB.С	B.VULG	ST.EP	ST.SAN
U.UREA	E.FEC	COR. Spp	+	-
U.UREA	E.FEC	COR. Spp	+	-
Примечание: PR.MIR - Proteus mirabilis, B.VULG - Bacteroides vulgates, KL.OXT - Klebsiella oxytoca, LAMB - ДНК фага , M.HOM - Mycoplasma hominis, ENT.FAEC - Enterococcus faecicum, FUS.NUC - Fusobacterium nucleatun, ST.EPID - Staphylococcus epidermidis, CORYN SPP - Corynebacterium spp., AN.PRE - Anaerobius prevotii, M.MUL - Mobiluncus mulieris, G.VAG - Gardnerella vaginalis, M.CAT - Mobiluncus cartisii, B.FRAG - Bacteroides fragilis, KL.PNEU - Klebsielle pneumoniae, PR.MEL - Prevotella melanogenica, UR.UR - Ureaplasma urealyticum, PREV.OR - Prevotella oralis, L.SPP - Lactobacillus spp, PEPT.AN - Peptostreptococcus anaerobius, E.coli - Esherichia coli, STR.SANG - Streptococcus sanguinis,

Исследование включает следующие стадии:

- выделение тотальной ДНК из образца биоматериала (с использованием набора для выделения «ДНК-экспресс» (НПФ «Литех», Россия, ФС 032а2002/0923-05));

- проведение полимеразной цепной реакции с целью получения меченых флуорофором Су5 продуктов амплификации фрагментов геномов выбранных микроорганизмов в соответствии с условиями проведения реакции, изложенными в таблице 1;

- проведение реакции гибридизации путем инкубации меченных флуорофором Су5 продуктов амплификации геномов идентифицируемых микроорганизмов на ДНК-чипе;

- отмывка ДНК-чипа после окончания гибридизации и высушивание чипа;

- регистрация результатов гибридизации с помощью многоканального сканера биочипов и анализ полученных флуоресцентных сигналов на предмет наличия или отсутствия определяемых микроорганизмов в испытуемом биообразце.

Проведение полимеразной цепной реакции

Подготавливают 3 стерильные пробирки объемом 0,2 мл для приготовления проб для амплификации ДНК. Каждая пробирка содержит следующие реагенты: водный раствор трех нуклеозидтрифосфатов (dATP, dTTP, dGTP) в концентрации 0,25 мкМ каждый (фирма «Силекс», Россия, кат 1310); нуклеозидтрифосфат dCTP в концентрации 0,2 мкМ (фирма «Силекс», Россия, кат 1310); нуклеозидтрифосфат dCTP, модифицированный Су5, в концентрации 0,05 мкМ (фирма «Синтол», Россия); два специфичных праймера, в концентрации 1 рМ каждый (фирма «Синтол», Россия); 1х ПЦР-буфер [раствор 0,66 М трис-HCl; 25 мМ MgCl ₂ (кат. Т 6791, фирма «Sigma», США)]; 0.05 ед./мкл Taq-полимераза (фирма «Promega», США); 3 мкг испытуемой ДНК-пробы. В каждую пробирку добавляют деионизованную воду до конечного объема смеси 25 мкл. Далее пробирки закрывают и устанавливают в ПЦР-амплификатор. На амплификаторе запускают установленную программу (таблица 1). После окончания реакции амплификации пробирку вынимали из амплификатора.

Проведение реакции гибридизации

ДНК-чип вставляют в рамку-держатель для чипов. Сверху на чип надевают рамку-трафарет.

В одной стерильной пробирке объемом 0,5 мл смешивают содержимое трех пробирок, содержащих продукты амплификации фрагментов геномов идентифицируемых микроорганизмов и добавляют равный объем гибридизационного буфера (150 мМ Na₃PO₄, рН 8,5). Полученную смесь подвергают инкубации при 95°С в течение 3 мин с последующим быстрым охлаждением смеси при на льду в течение 2 мин после денатурации ДНК.

На поверхность одной ограниченной области ДНК-чипа вносят 40 мкл смеси денатурированных продуктов амплификации ДНК идентифицируемых микроорганизмов. Рамку-держатель закрывают крышкой. Чип инкубировали в термошейкере при температуре 42°С при вращении платформы 300 об/мин в течение 2 ч.

Регистрация и анализ результатов

После проведения анализа чип сканируют на многоканальном сканере для биочипов, активируя канал Су5. Сканированные изображения сохраняют в формате tif. Сканированные образы в формате tif открывают в специальной программе для последующей интерпретации изображения. Процедуру проводят согласно инструкции (описанию) к конкретному программному обеспечению. В данной программе вносят все необходимые параметры для точного наложения «сетки» по центру локализации спотов. Полученные результаты сохраняют в формате Excel.

Результат анализа считают валидным, если на чипе при сканировании на канале Су5 визуально наблюдают ярко флуоресцирующие споты в положениях, соответствующих положительному контролю и отсутствует сигнал в спотах с отрицательным контролем.

В заключение выдают качественный результат исследования: положительный - в случае наличия соответствующих микроорганизмов в испытуемом биообразце, отрицательный - в случае отсутствия соответствующих микроорганизмов в испытуемом биообразце.

Варианты осуществления настоящей полезной модели

Пример 1. У пациентки А. с подозрением на ИППП и соответствующими жалобами (выделения из половых путей с неприятным запахом, дизурия), стандартным способом получали образец биоматериала (отделяемое со слизистых оболочек урогенитального тракта). Идентификацию 21-го условно-патогенного микроорганизма в исследуемом биообразце проводили в соответствии с предлагаемым способом.

В результате исследования биологического материала, полученного от пациентки, с помощью ДНК-чипа идентифицированы микроорганизмы: Bacteroides vulgatus, Fusobacterium nucleatum, Mycoplasma hominis, Gardnerella vaginalis, Mobiluncus mulieris, Mobiluncus cartisii, Anaerobius prevotii, Bacteroides fragilis, Prevotella melanogenica, Prevotella oralis, Peptostreptococcus anaerobius.

Таким образом, в результате проведенного клинико-лабораторного обследования установлен диагноз: Бактериальный вагиноз.

Пример 2. У пациента Б. с подозрением на наличие инфекции урогенитального тракта (жалобы на выделения гнойного характера из уретры, учащение и боли при мочеиспускании) стандартным способом получали образец биоматериала (соскобы со слизистых оболочек урогенитального тракта). Идентификацию 21-го условно-патогенного и непатогенного микроорганизма в исследуемом биообразце проводили в соответствии с предлагаемым способом. Кроме этого, осуществлялась идентификация облигатно-патогенных микроорганизмов - возбудителей ИППП (Trichomonas vaginalis, Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae) общепринятыми методами.

В результате исследования биологического материала, полученного от пациента, с помощью ДНК-чипа идентифицированы микроорганизмы: Ureaplasma urealyticum, Mycoplasma hominis, Proteus mirabilis, Bacteroides vulgatus, Klebsiella oxytoca, Enterococcus faecium, Fusobacterium nucleatum, Staphylococcus epidermidis, Anaerobius prevotii, Mobiluncus mulieris, Mobiluncus cartisii, Bacteroides fragilis, Klebsiella pneumoniae, Prevotella melanogenica, Prevotella oralis, Peptostreptococcus anaerobius, Escherichia coli, Enterococcus faecalis.

На основании проведенного клинико-лабораторного обследования, а также учитывая результаты анализа на наличие облигатно-патогенных микроорганизмов пациенту установлен диагноз: Негонококковый уретрит.

Пример 3. У пациентки К., проходившей профилактический медицинский осмотр, стандартным способом получали образец биоматериала (соскобы со слизистых оболочек урогенитального тракта). Идентификацию условно патогенных и непатогенных микроорганизмов в исследуемом биообразце проводили в соответствии с предлагаемым способом.

В результате исследования биологического материала, полученного от пациентки, с помощью ДНК-чипа идентифицированы микроорганизмы: Lactobacillus spp, Escherichia coli, Proteus mirabilis.

Заключение: В результате проведенного клинико-лабораторного обследования установлено: Пациентка здорова.

ДНК-чип для комплексной идентификации условно-патогенных возбудителей урогенитальных инфекционных заболеваний, представляющий собой размещенную в рамке-держателе пластинку с нанесенными на ее поверхности олигонуклеотидными зондами для детекции микроорганизмов и детекции флуоресцентного сигнала на чипе, отличающийся тем, что на пластинке нанесены дополнительные зонды для определения в биологическом образце пациента двадцати одного условно-патогенного микроорганизма, причем зонды выполнены продублированными, и выполнены ограниченные области для одновременного проведения двенадцати исследований определяемых микроорганизмов, при этом ДНК-чип выполнен с возможностью осуществления отрицательного контроля путем использования для мечения дезоксирибонуклеотидов, несущих флуорохром Су5.