Биосенсор для определения дихлорметана

Полезная модель относится к области биотехнологии и охраны окружающей среды, а именно к устройствам для определения органических веществ, в частности - для определения дихлометана.

Предложен биосенсор, включающий кислородный электрод Кларка, сопряженный с предварительно сформированным биорецептором, содержащем иммобилизованные на хроматографической стеклобумаге клетки аэробных метилотрофных бактерий Methylobacterium dichloromethanicum ДМ4, способных к биодеградации дихлометана. Нижний предел детекции ДХМ - 3 мМ, операционная стабильность - 3 суток, продолжительность одного анализа - 3-5 мин.

Полезная модель относится к области биотехнологии и охраны окружающей среды, а именно к устройствам для определения органических веществ, в частности, для определения дихлометана.

Дихлорметан (ДХМ) - летучее токсичное соединение, широко используемое в промышленности в качестве растворителя и хладагента (Троценко, Торгонская, 2009). Промышленное производство его достигает 300000 т/год (Keene et al., 1999), тогда как биогенное образование незначительно (Дембицкий, Толстиков, 2003). ДХМ оказывает канцерогенное и мутагенное действие на живые организмы (Green, 1997; Thier et al., 1998; Mizutani et al., 1988), а также с трудом разлагается абиотически, особенно в водных системах.

Поскольку в водных средах период полураспада ДХМ составляет до 700 лет, а в атмосфере 70 суток, он считается одним из основных загрязнителей воды и атмосферы (Dhillon, Von Burg, 1995; Law, Sturges, 2007). Поэтому проблема биодеградации этого опасного поллютанта весьма актуальна. Актуальной задачей остается также разработка высокочувствительных, экспрессных, селективных и простых по конструкции аналитических устройств для определения ДХМ в промышленных и городских стоках.

Биодеградацию дихлорметана обычно определяют по возрастанию ионов хлора, с помощью газовой хроматографии или с использованием радиоизотопов [Krausova et al., 2003]. Разработан такой метод как хроматография газовой фазы над жидкостью для определения ДХМ в моче [Sakai et al., 2002]; линейный диапазон определения концентраций ДХМ в этом случае составляет 0.01-2 мг/л. Концентрацию ионов хлора в культуральной жидкости клеток определяют также спектрофотометрически [Jörg, Bertau, 2004].

Эти методы не могут быть применены для измерений концентрации ДХМ непосредственно на месте отбора проб.

Известна биосенсорная система для определения ДХМ. Анализ был основан на клетках Hyphomicrobium DM2, иммобилизованных в альгинат. В работе использовали комбинацию преобразователей, состоящую из проточного калориметра и электрода, чувствительного к ионам хлора. Предел детекции такой системы составлял 0,1 мкМ ДХМ [Henrysson, Mattiasson, 1993].

Задача, на решение которой направлена заявляемая полезная модель - создание устройства, простого по конструкции и эксплуатации, для быстрого и чувствительного определения дихлорметана.

Технический результат, который может быть получен при использовании предлагаемой полезной модели, заключается в том, что биосенсор обеспечивает быстрое определение содержания дихлометана без использования сложного дорогостоящего оборудования.

Сущность полезной модели.

Предложен биосенсор для определения дихлорметана, включающий кислородный электрод Кларка (1), сопряженный с предварительно сформированным биорецептором (2), содержащем иммобилизованные на хроматографической стеклобумаге клетки аэробных метилотрофных бактерий штамма Methylobacterium dichloromethanicum ДМ4. Биорецептор закрепляют на электроде с помощью специального фиксатора (3). Электрод погружен в измерительную ячейку (4) с буферным раствором (Фиг.1).

Формирование биорецептора осуществляют отдельно от электрода Кларка. Для приготовления рецепторного элемента биосенсора используют суспензию бактериальных клеток, являющихся аэробными деструкторами ДХМ - Methylobacterium dichloromethanicum ДМ4 (ВКМ В-2191=DSMZ 6343) (Doronina et al., 2000). Бактерии выращивают на среде «К», содержащей (г/л): KH₂PO₄ - 2, (NH₄) ₂SO₄ - 2, NaCl - 0.5, MgSO₄×7H ₂O - 0.025, FeSO₄×7H₂O - 0.002, pH 7.2, при 29°С в колбах объемом 0.75 л на качалке (180 об/мин). В качестве источников углерода и энергии добавляют дихлорметан, СН₂Сl₂ (10 мМ). При культивировании на СН₂Сl₂ колбы Эрленмейера объемом 300 мл с 50 мл среды закрывают завинчивающимися крышками с резиновой мембраной (Precision Sampling Corp., Baton Rouge, США). ДХМ вносят в среду через мембрану шприцем порциями до конечной концентрации 10 мМ. По мере сдвига pH до 5.0 добавляют 3 М NaOH до pH 7.0.

Выращенные таким образом клетки центрифугируют при 10000 g в течение 3 минут, затем промывают 2 раза фосфатным буфером (pH 7,0) и суспендируют в определенное количество такого же буфера. 5 мкл суспензии клеток наносят на мембрану - хроматографическую стеклобумагу GF/A размером 3×3 мм² (Whatman, Великобритания) и подсушивают на воздухе в течение 10-15 минут. Эта мембрана и является биорецептором биосенсора.

M. dichloromethanicum ДМ4 являются аэробными метилотрофными бактериями, использующими ДХМ в качестве источника углерода и энергии (Doronina et al., 2000). Дихлорметандегалогеназа, фермент катализирующий трансформацию ДХМ, индуцируется при выращивании клеток на ДХМ. И хотя первая реакция разложения ДХМ не зависит от кислорода, потребление клетками ДХМ сопровождается поглощением кислорода, что можно зарегистрировать, используя полярографическую систему (например, электрод Кларка).

Биосенсор работает следующим образом.

Электрод Кларка (1) с размещенным на нем биорецептором (2), содержащим иммобилизованные клетки штамма Methylobacterium dichloromethanicum ДМ4, погружают в измерительную ячейку (4) объемом 2 мл с буферным раствором (1 мМ калий-фосфатный буфер, содержащий 0,015 М NaCl, pH 7,0) и регистрируют базовый уровень электрического сигнала, отражающий содержание кислорода в среде (фоновое). Добавляют аликвоту анализируемого образца и регистрируют изменение сигнала электрода, отражающее потребление кислорода в ходе биодеградации ДХМ через 100 с после введения образца. (I, мкА). На основании полученных данных строят калибровочную кривую (Фиг.2).

Для определения неизвестной концентрации ДХМ после стабилизации базовой линии добавляют раствор неизвестной концентрации и затем по калибровочной кривой (Фиг.2), отражающей зависимость сигнала сенсора от концентрации ДХМ, определяют концентрацию ДХМ в анализируемом образце.

Принципиальными особенностями, отличающими предлагаемый биосенсор от известных устройств для определения ДХМ являются:

1) Использование кислородного электрода Кларка в качестве преобразователя сигнала биосенсора.

2) Применение в биорецепторе уникальных микроорганизмов Methylobacterium dichloromethanicum ДМ4, способных к биодеградации ДХМ.

Нижний предел детекции ДХМ составил 3 мМ, операционная стабильность - 3 суток, продолжительность одного анализа - 3-5 мин. Коэффициент вариации (отношение среднеквадратичного отклонения к среднему арифметическому значению сигнала) составил 5-10%.

На фиг.1 представлена схема биосенсора на основе кислородного электрода Кларка для определения дихлорметана.

На фиг.2 приведена калибровочная кривая биосенсора для определения дихлорметана.

Таким образом, разработан биосенсор для определения дихлорметана, который обеспечивает быстрое определение содержания ДХМ в образце без использования сложного дорогостоящего оборудования и который может быть использован в полевых условиях, т.е. непосредственно на месте отбора образцов.

Список цитируемых источников:

1. Dhillon S., Von Burg R.J. Toxicology update. Methylene chloride. // Appl. Toxicol., 1995, V.15, P.329-335.

2. Doronina N.V., Trotsenko Y.A., Tourova T.P., Kuznetsov B.B., Leisinger T. Methylopila helvetica sp. nov. and Methylobacterium dichloromethanicum sp. nov. - novel aerobic facultatively methylotrophic bacteria utilizing dichloromethane. // System. Appl. Microbiol. 2000. V.23. P.210-218.

3. Green T. Methylene chloride induced mouse liver and lung tumours: an overview of the role of mechanistic studies in human safety assessment. // Hum. Exp. Toxicol., 1997, V.16, 1, P.3-13.

4. Henrysson Т., Mattiasson В. A microbial biosensor system for dihalomethanes. // Biodegradation, 1993, V.4, P.101-105.

5. Jörg G., Bertau M. Thiol-tolerant assay for quantitative colorimetric determination of chloride released from whole-cell biodehalogenations. // Anal Biochem, 2004, V.328, P.22-28.

6. Keene W.C., Khalil M.A.K., Erikson III D.J., McCulloch A., Graedel Т.Е., Lobert J.M., Aucott M.L., Gong S.L., Harper D.B., Kleiman G., Midgley P., Moore R.M., Seuzaret C., Sturges W.T., Benkovitz C.M., Koropalov V., Barrie L.A., Li Y.-F. Composite global emissions of reactive chlorine from anthropogenic and natural sources: Reactive chlorine emissions inventory. // Geophys. Res., 1999, V.104, P.8429-8440.

7. Krausova V.I., Robb F.T., Gonzalez J.M. Bacterial degradation of dichloromethane in cultures and natural environments. // Journal of Microbiological Methods, 2003, V.54, 3, P.419-422.

8. Law K.S., Sturges W.T. Halogenated very short-lived substances. Scientific assessment of ozone depletion: 2006. // Global ozone research and monitoring project - Report 50 / Ed.: C.A. Ennis. Geneva: World Meteorol. Org., 2007, 572 p.

9. Mizutani К., Shinomiya К., Shinomiya Т. Hepatotoxicity of dichloromethane. // Forensic Science International, 1988, V.38, 1-2, P.113-128.

10. Sakai Т., Morita Y., Wakui Ch. Biological monitoring of workers exposed to dichloromethane, using head-space gas chromatography. // Journal of Chromatography B, 2002, V.778, 1-2, P.245-250.

11. Thier R., Wiebel F.A., Hinkel A., Burger A., Brüning Т., Morgenroth K., Senge Т., Wilhelm M., Schulz Т.G. Species differences in the glutathione transferase GSTT1-1 activity towards the model substrates methyl chloride and dichloromethane in liver and kidney. // Arch. Toxicol., 1998, V.72, 10, P.622-629.

12. Дем6ицкий В.М., Толстиков Г.А. Природные галогенированные органические соединения. // Новосибирск: Изд-во СО РАН, филиал "Гео", 2003, 366 с.

13. Троценко Ю.А., Торгонская М.Л. Аэробная биодеградация дихлорметана: структурно-функциональные аспекты (обзор). // Прикладная биохимия и микробиология, 2009, Том 45, 3, С.261-276.

Биосенсор для определения дихлорметана, включающий кислородный электрод Кларка, сопряженный с предварительно сформированным биорецептором, содержащим иммобилизованные на хроматографической стеклобумаге клетки аэробных метилотрофных бактерий штамма Methylobacterium dichloromethanicum ДМ4, способных к биодеградации дихлометана.