Способ электрофоретического разделения изоферментов - амилазы

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

Союз Советских

Социалистических

Республик (61) Дополнительное к авт. сеид-ву (22) Заявлено 31.01.78 (21) 2573934/30 — 15 с присоединением заявки № (23) Приоритет (51) М. Кл.2

G 01 N 27/2б

Государствеииый комитет

СССР ио делам изобретеиий и открытий (5Ç) )/ДК 581. 1,083 (088.8) Опубликовано 250879. Бюллетень ¹ 31

Дата опубликования описания 25.0879 (72) Авторы изобретения

О,В Фурсов и Т.Б. Дарканбаен (71) Заявитель

Институт ботаники АН Казахской CCP (54) СПОСОБ ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКО1 О РАЗДЕЛЕНИЯ

ИЗОФЕРМЕНТОВ сС, -АМИЛАЗЫ

Изобретение относится к способам биохимического исследования гетерогенности белка.

Известны способы разделения белков путем электрофореза на полиакриламидном геле для выявления гетерогенности природных смесей и выделения препаратов белкон растений.

Известен способ электрофоретического разделения сС -амилаз на полиакриламидном геле, где электрофорез проводят после прогрева амилазных вытяжек при 70 С в течение 15 мин, чем достигается подавление активности Р -амилазы (1) .

Недостатком этого способа является то, что. нагревание ферментов приводит к подавлению активности не только -амилазы, но и некоторых термолабильных изоферментов с(. -амилазы.

Известен также способ электрофоретического разделения изоферментов с .-амилазы зерна злаковых на

25 полиакриламидном геле, содержащем мочевину в концентрации 5 молей (2), Активность иэоферментов (Ъ -амилазь в известном способе подавляют мочевиной, содержащейся в геле. Полимериэация геля по этому способу происходит в течение нескольких минут н присутствии катализатора N N N N-тетраметилендиамина (ТЕМЕДа) в количестве О, 7%. Электрофоретическое разделение ведут н дна этапа: в течение первых 40 мин при плотности тока

20 A/м, а затем еще н течение 1 час при плотности тока 51 А/м. Напряжение меняется от 120 В на первом этапе электрофореза до б00 B на втором этапе. Указанный режим способствует быстрому движению изоферментон сквозь гель, в результате чего происходит недостаточное пространственное разделение изоферментов. Для получения четкого разделения в данном способе необходимо значительно увеличить длину разгона изоферментов н геле и соответственно-продолжительность электрофореза.

Длительное же проведение электрофореза приводит к разрушению геля, Гель, используемый в данном способе, является нестабильным вследствие высокого содержания катализатора ТЕМЕДа, Высокое, постоянно унеличинающееся напряжение при проведении электрофореза сказынается как на стабильности геля, так и на достоверности конечных результатов.

681362

1,0

4,8

0,23 60

Остальное

30,0

0,8

20,0 65

Остальное

Недостатком этого способа янляется и значительное изменение рН в процессе электрофореза, что также влияет на воспроиэводимость реэультатон электрофореза.

Целью изобретения является повышение эффективности разделения и ста- 5 бильности результатов электрофореза.

Это достигается тем, что электрофоретическое разделение ведут при рН 8,3-0,2 и при следующих параметрах каждого этапа: 1 этап — 20-35 жн 10 г при плотности тока 10-12 А/м и напряжении 75-85 В; 2 этап — 30-70 мин при плотности тока 20-30 A/M и напряг жвнии 480-520 В, Такое уменьшение плотности тока и напряжения возможно за счет повышения удельного электрического сопротивления геля, достигаемого путем уменьшения содержания катализатора в геле в 8-10 раз. Снижение содержания катализатора в геле дало возможность получить гель необходимой плотности, стабилизировало его, а указанный режим электрофореза позволил разделять иэоферменты на меньшей длине геля.

Для понышения стабильности режима разделения рН трис(гидроксиметил)-аминометан-глициноного электродного буфера в катодном и анодном резервуарах поддерживают на постоянном уровне.

Это достигается увеличением концентра-30 ции компонентов буферного раствора вдвое по сравнению с его концентрацией по прототипу.

При осуществлении предлагаемого способа все операции выполняются в 35 определенной последонательности. Сначала готовят полиакриламидный гель, полимериэацию которого проводят н стеклянных трубках. Затем помещают концы трубок в сосуды с электродным 40 буфером. Не вступившие н полимериэацию вещества удаляют предварительным электрофорезом. Далее наносят белок на торцовую поверхность геля, к электродному буферу подают постоянное напряжение, причем катодом является буфер, граничащий с торцом геля, на который нанесен белок. Электрофорез ведут при постоянном рН. После этого проявляют зоны с(. -амилаэной активности.

Пример. Электрофорез d. амилазы зерна злакОвых проводят следующим образом. Для приготОвления геля готовят рабочие водные растворы следующего состава, вес.Ъ: 55

Раствор 1.

Три с (гидро к симетил)— аминометан

Глицин

ТЕМЕД

Вода

Раствор 2 °

Акриламид

Метиленбисакриламид

Мочевина

Вода

Раствор 3.

Ксченина 50,0

Аммоний надсерноки слый 0,14

Вода Остальное

Растворы, содержащие мочевину, готовят н день использоьания. Полиакриламидный гель готовят смешиванием трех водных растворов в соотношении 2 : 2 : 4.Смесь разливают по трубкам 75 мм х 5 мм. Полимеризацию проводят при комнатной температуре н течение 30 мин.

В состав электродного буфера входит (нес.Ъ) трис(гидроксиметил)-аминометан 0,12 и глицин 0,50. Электродный буфер применяют охлажденным до

6,0-8,0 С. В качестве источника тока о может служить УИП-1 (универсальный источник питания).

Проводят предварительный электрофорез без нанесения белка в течение

40-60 мин при напряжении 200-250 В.

Затем на гель наносят белок в 40%-ной сахарозе в количестве 50-100 мкг на трубку. Электрофорез ведут сначала при напряжении 75-85 В в течение 2025 мин, а затем продолжают разделение в течение 1 час при напряжении

480-520 В.

Плотность тока на перном этапе не превышает 12 A/м, а на втором эта2 пе доходит до 30 А/м.

По окончании электрофореза гель извлекают из трубок и помещают на

1 час в холодильник н пробирках, содержащих 1%-ный крахмал на 0,1 М ацетоновом буфере, рН 5,0. Затем гель промывают водой, проявляют зоны

c(.-амилазной активности раствором, содержащим, вес.% 3< 0,14 и KJ 0,38 и 5Ъ-ной трихлоруксусной кислоте, и фотографируют.

На чертеже сравниваются электрофотограммы с(-амилаз прорастающего зерна различных сортов пшеницы, полученные по предлагаемому способу:

1 — д.-амилаз Аед10орн апсЬег1

Boiss, subsp, virigata Zhukovsky

2 — с(. -амилаз Ae. speEtoides

Tausch., subsp. 3igustica

Fiorivar. scandens Zhukovsky

3 — с - -амилаэ твердой пшеницы Накат

4 — d -амилаз твердой плешинцы Мелянопус 26

5 — с4 -амилаэ мягкой пшеницы Саратонская 29 .

Предлагаемый способ позволяет устанавливать сортовые, нидовые и родовые различия апектров ct -амилазы зерна.

Способ прошел проверку н лабораторных условиях. Установлены особенности спектров о -амилазы зерна более чем 40 сертон мягкой и твердой пшеницы и 20 видов рода Эгилопс.Полученные данные очень хорошо коррели руют с фенологическими исследонания681362

Формула изобретения

123) Составитель M. Дранишников

P дактор M. Рогова Техред М.Петко Еорректор В. Бутяга

Тираж 1090 Подпи си ое

ЦНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035 Москва Ж-35 Раушская наб. д. 4/5

Заказ 5079/41

Филиал ППП Патент, г ° Ужгород, ул. Проектная,4 ми рода Эгилопс, выполненными другими новейшими способами. Способ был использован также для выявления гибридных и мутантных семян пшеницы.

Способ электрофаретического разделения изоферментов . -амилазы на полиакриламидном геле, приготовленном на трис(гидроксиметил)-аминометанглициновом буфере и содержащем мочеви-1Q ну и N N N N-тетраметилендиамин,о тл и ч а ю шийся тем, что, с целью повышения эффективности разделения и стабильности результатов, электрофоретическое разделение ведут при рН 8,3-0,2 первые 20-35 мин при плотности тока 10-12 A/м и напряжении 75-85 В а последующие 30-70 мин

2 при плотности тока 20-30 A/ì и напряжении 480-520 В.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Ивлев И. Доклады Болгарской

Академии Наук, т. 25, 9 6, с. 833835, 1972.

2. Перуанский (0.В, и Фурсов О.В.

Унификация методики изучения изозимов зерновых амилаз (Физиология и биохимия культурных растений, т. 6, вып. 4, 1974, с ° 439-442 (прототип),