Способ исследования кинетики взаимодействия компонентов раствора

О П И С А Н И Е 469938

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советских

Социалистических

Республик (61) Зависимое от авт. свидетельства— (22) Заявлено 12.07.72 (21) 1811034j26-25 с присоединением заявки— (32) Приоритет—

Опубликовано 05.05.75. Бюллетень ¹ 17

Дата опубликования описания 10.02.76 (о1) М. Кл. G 01п 23/20

Государственный комитет

Совета Министров СССР (53) Ъ ДК 543.52:543.9 (088,8) ll0 делам изобретений и открытий (72) Авторы отзоб ретения

А. Н. Шутко и Н. Н. Шатинина (71) Заявитель

Центральный научно-исследовательский рентгено-радиологический институт (54) СПОСОБ ИССЛЕДОВАНИЯ КИНЕТИКИ

ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ КОМПОНЕНТОВ РАСТВОРА

: — --:Н вЂ” ДНК

ОНН"

НН "О;

- ННОи (2) Изобретение относится к способам исследования свойств растворов биополимеров и может быть использовано в молекулярной G»ологии, биофизике и биохимии в тех случаях, когда необходимо обнаружить и количественно оцепить аномалии подвижности и надмолекулярной организации в одних компонентах раствора, возникающих вследствие модифицирующего влияния других.

Известен способ обнаружения аномального состояния растворителя в растворе ДНК, основанный на изучении кинетики прямого изотопного .водородного обмена между водой и молекулами ДНК. Согласно этому спосооу, экстремальный характер кинетической кривой обмена свидетельствует о наличии в растворе взятого биополимера дополнительной фазы воды с ограниченной способностью к водородному обмену. Это утверждение основывается на следующих модельных представлениях: если растворитель представляет собой единую фазу, т. е. состоит из молекул воды (ННО), способных обменивать свой водород с обменоспособным водородом ДНК (Н вЂ” HK) только с единой скоростью, то, согласно молекулярно-статистической природе водородного обмена, кинетика прямого включения меченого водорода Н " из растворителя в ДНК может быть только монотонной:

Б случае разделения растворителя па две фазы с различной лабпльностью атомо» водорода в пределе каждой фазы (например, благодаря модифицирующему воз 1ействпю молекул ДНК) система усложняется. В простейшем варианте, когда одна из фаз растворителя (например, фаза 1) приходит в пзотопное равновесие с добавляемым коли-;ест. вом индикаторных молекул существенно затруднен, возникают различные условия для прямого включения метки в

Н вЂ” ДНК, находящихся в пределах объемов, 20 занимаемых этими фазамп. Так, если I(. К, 70 после быстрого накопления метки в H — ДНК в период времсни, когда реакция (2) палс(0 от изотопного равновесия, следует снижение концентрации метки в Н вЂ” ДНКи до концсн25 траций, соответствующих равновесным.

Включение метки в Н вЂ” ДНКп происходит монотонно по мере приближения реакции (2) к изотопному равновесию. Суммарная кинеЗ0 тика включения метки в (Н вЂ” ДНК, -1469918

1О

+Н вЂ” ДНКн), таким образом, обнару>кивает отклонения от монотонности, характер которых зависит от конкретных условий.

Недостатком известного способа обнаружения модифицирующего влияния молекул

ДНК на состояние воды является то, что эти модельные представления, положенные в его основу, могут быть оспорены. Так, например, можно допустить, что растворитель не испытывает модифицирующего влияния со стороны макромолекул и представляет собой единую фазу, а немонотонная форма кинетики прямого водородного обмена, полученная в эксперименте, целиком является следствием происходящих в молекулах ДНК периодических синфазных в макрообъеме раствора конфармационных изменений, существование которых в настоящее время доказано для некоторых других молекул биополпмеров, находящихся в растворимом состоянии.

Цель изобретения — повышение воспроизводительности результатов способа обнаружения аномалий подвижности растворителя в растворе биополимера, основанного на определении кинетики прямого водородного изо топного обмена между растворителем и растворенными молекулами.

Согласно изобретению, поставленная цель достигается тем, что в исследуемый раствор, состоящий из воды и растворенных в ней молекул ДНК, заранее вводят третий компонент — низкомолекулярное по сравнению с

ДНК вещество P — Н, содержащее обменоспособный водород.,При этом количество обменоспособного водорода должно быть много больше, чем количество обменоспособного водорода ДНК (первое условие); скорость его обмена с водородом окружающей воды должна быть соизмерима со скоростью обмена водорода между молекулами самого растворителя, не содержащего растворенных веществ (второе условие).

В такой системе третий компонент выполняет функции опосредственного свидетеля состояния растворителя.

Так, кинетика прямого включения меченого водорода из растворителя в обменоспособный водород органики будет складываться из двух процессов:

НН "О Н вЂ” ДНК (3) Н Н" О Н вЂ” R (4) Согласно первому условию, измеряемая в эксперименте кинетика включения изотопа из растворителя в растворимые вещества будет целиком определяться уравнением (4). Если в системе растворитель не подвергается модифицирующему влиянию ДНК и представляет собой единую фазу, то в силу молекулярно-статистической природы водородного обмена будет наблюдаться монотонная кинети20

«а прямого llao ollaol o водородного об>»сна из растворителя в вещество — свидетель.

Если в системе существуют две фазы растворителя, то равномерно распределенное в обоих фазах вещество — свидетель будет накапливать изотоп r, различных условиях. Так, согласно второму условию, задолго до наступления равновесия в реакции (2) произойдет накопление метки в Н вЂ” Кь которое посте пенно сменится исчезновением ее до уровня равновесных значений реакции (2) по мере достижения изотопного равновесия в ней. В то

>ке время в аномальной фазе 11 растворителя включение метки в Н вЂ” Кн будет осуществляться монотонно по мере накопления метки в этой фазе.

В результате суммарная кинетика будет немонотонной, однако теперь такое отклонение невозможно трактовать с позиций конфармационной подвижности молекул ДНК и надежность вывода о наличии именно модифицирующего влияния ДНК на растворитель становится абсолютной.

Способ был реализован с раствором ДНЕ (м. IB. = 1 . 10 дальтон) при концентрации

500 мкг/мл. В качестве метки использовался тритий .в виде НТО при концентрации ! 0 мкюри/мл. Веществом — свидетелем служил цитрат натрия в концентрации 0,04 М.

Началом реакции обмена служило соединение

0,01 мл раствора НТО в 0,15 М NaC1 и 0,04М цитрата натрия и 0,1 мл раствора ДНК в в 0,15 М NaC1 и 0,04 М цитрата натрия.

Обмен происходил при комнатной температуре, остановка его осуществлялась замораживанием образцов при температуре жидкого азота. Лиофилизация осуществлялась в два этапа: при — 30 С в течение 6 час, затем при постепенном подъеме температуры до 45 С в течение 8 час. Измерение образцов производилось на двухканальном жидкостном сцинтилляционном счетчике «Picket — Хцс1еаг» со сцинтиллятором обычного состава (3 г PPO + 0,3 г РОРОР+100 г нафталина на л диоксана) при эффективности 30 /О.

Вид кинетики включения трития в цитрат натрия показан на чертеже. Форма этой кинетики свидетельствует о наличии в растворе фазы воды с ограниченной способностью к водородному обмену.

Предлагаемый способ может быть полезен не только при обнаружении модифицирующего влияния растворенного биополимера на растворитель. Он может быть использован, например, для обнаружения взаимодействия биополимера с самим веществом — свидетелем с целью оценки характера этого взаимодействия. В этом случае должна меняться кинетическая характеристика кривой включения метки в P — Н в присутствии биополимера.

469918

Предмет изобретения

0 5!

0 г5 N 25

Юрв ча, cer

Составитель Е. Никитина

Техред Т. Миронова

Корректор И. Симкина

Редактор Т, Орловская

Заказ 1289/1848 Изд, ¹ 812 Тираж 902 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Тип. Харьк. фил. пред. «Патент».

1. Способ исследования кинетики взаимодействия компонентов раствора биополимера, например, молекул ДНК путем прямого изотопного водородного оомена между растворителем и растворенным веществом, отгггчагошиася тем, что, с целью повышения воспроизводимости результатов, в раствор биополимера в":,îëÿò низкомолекулярное вещество, например, цитрат натрия, имеющее большее по сравненшо с биополимером, количество водорода со скоростью его обмена в растворе, соизмеримой со скоростью обмена водорода в свободном растворителе.

2. Способ по и. 1, отлггчаюгггийся тем, что цптрат натрия берут в концентрации 0,04М.