Способ получения 7-р/в-5-амино-5-
») 446976
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
Союз Советских
Социалистических
Республик (61) Зависимый от патента (22) Заявлено 12.03.71 (21) 1631862, 31-16 (32) Приоритет 13.03.70 (31) 19496 (ЗЗ) США
Опубликовано 15.10.74. Бюллетень № 38 (51) М. Кл. С 12Й 9/14
Государственный комитет
Совета Министров СССР ло делам нзабретений и открытий (53) УДК 615.779.931 (088.8) Дата опубликования описания 11.11.75 (72) Авторы изобретения
Иностранцы
Эдвард Оллей Старлей (США) и Хусто Мартинез Мата (Испания) Иностранная фирма
«Мерк энд Компани, Инк«» (США) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕН ИЯ 7-р/D-5-АМИ НО-5АРБОКСИВАЛЕРАМИДО /-3-/ КАРБАМОИЛОКСИМЕТИЛ/
/-7-МЕТОКСИ-3-ЦЕФЕМ-4-КАРБОНОВОЙ КИСЛОТЫ (ЦЕФАМИЦИНА С) Изобретение относится к производству антибиотиков.
Предложенный способ получения 7-P/D5-амино-5 - карбоксивалерамидо /-3-/ карбамоилоксиметил/-7-метокси-3-цефем-4 - карбоновой кислоты (цефамицина С), ранее в патентной литературе не описанный, заключается в том, что культуру Streptomyces 1асtamdurans 1чКК1 3802 выращивают в аэробных условиях на среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, при 20 — 37 С и рН среды 6,0 — 8,0 в течение
2 — 4 дней с последующим выделением целевого продукта. В качестве источников углерода используют, например, углеводы, содержание которых в среде составляет 1 — 6 вес. /о, а содержание источника азота в среде составляет 0,2 — б вес. .
Полученный предложенным способом антибиотик (цефамицин С) обладает высокой активностью в отношении грамм-отрицательных бактерий, низкой токсичностью и устойчив к энзиматическому. воздействию.
Штамм Streptomyces 1actamdurans 1чЯЯ1
3802 выделен из земли и на различных питательных средах имеет следующие особенности, Агар Чапека-Докса. Вегетативный мицелий плоский, густо-кремовый. Воздушный мицелий порошкообразный, кремовато-белый.
Растворимый пигмент отсутствует.
5 Пищевой агар. Вегетативный мицелий плоский, кремовый, золотисто-желтый. Воздушный мицелий порошкообразный, кремовый. Растворимый пигмент отсутствует.
Глицерин-аспарагиновый агар. Вегетатив10 ный мицелий плоский, золотисто-желтый до оранжевого. Воздушный мицелий порошкообразный, кремовый с бледно-персиковым оттенком. Растворимый пигмент бледно-янтарный.
15 Агар на основе — дрожжевой экстракт— декстроза. Вегетативный мицелий плоский, золотисто-желтый. Воздушный мицелий порошкообразный, кремовый с розовым оттенком. Растворимый пигмент отсутствует.
20 Агар на основе синтетического крахмала.
Вегетативный мицелий плоский, кремовый с оранжевыми краями. Воздушный мицелий порошкообразный, белый с персиковыми краями. Растворимый пигмент отсутствует.
Частичный гидролиз крахмала.
Кусочки картофеля. Вегетативный мицелий сухой плоский, кремовый с оранжевой окра44G976
10,0
10,0
2,0 мл
0,05
91,0
95,0 25 ской. Воздушный мицелий редкий, кремоватый. Растворимый пигмент отсутствует.
Столбик желатины. Вегетативный мицелий редкий кремовый с оранжевым оттенком, распределенный по всему столбику агара. 5
Лакмусовое молоко. Вегетативный мицелий рыжевато-коричневый, редкий, кольцеобразный. Воздушный мицелий отсутствует.
Пептонизация: щелочная реакция рН 7,8—
7,4 (контрольный рН 6,7). 10
Пример 1. Лиофилизированной культурой Streptomyces 1actamdurarks ИКК1 3802 инокулируют колбы Эрленмейера, содержащие по 50 мл питательной среды следующего состава, r: 15
Дрожжевой автолизат
Глюкоза
Фосфатный буфер
MgSO4 7Н,О
Дистиллированная 20 вода 1000 мл рН среды 6,5
Состав фосфатного буфера, г:
КН2Р04
Na HPO4
Дистиллированная вода 1000
Инкубируют в течение трех дней при 28 С на роторной качалке, имеющей 220 об/мин и размах 508 мм. Затем содержимое колб сте- 30 рильными пипетками переносят в четыре колбы такого же размера, содержащие вышеуказанную среду, после чего эти колбы встряхивают на качалке описанным выше способом. Содержимое этих четырех колб 35 затем аккуратно сливают в одну колбу и используют для инокулирования 11 двухлитровых колб Эрленмейера, в каждой из которых содержится по 350 мл среды следующего состава, г: 40
Дрожжи янтарные тип 300 10
Барда 20
Декстроза 10
Дистиллированная вода 1000 мл 45
Затем колбы встряхивают в течение 4 дней при 28 C на роторной качалке, имеющей
145 об/мин и размах 50,8 мм. В конце инкубационного периода содержимое 10 таких колб объединяют и полученную пробу цент- 50 рифугируют для отделения мицелия.
Присутствие в культуральной жидкости антибиотика, т. е. 7-р-/D-5-амино-5-карбоксивалерамидо/-3-/карбамоилоксиметил/ - 7 - метокси-3-цефем-4-карбоновой кислоты опре- 55 деляют агар-диффузионным методом, используя бумажные фильтровальные диски диаметром 12,7 мм. Диски окунают в культуральную жидкость и помещают на поверх- ность чашек Петри, в которых находится 60
10 мл питательного агара (Difco) и 0,2О/о-ный дрожжевой экстракт (Difco) с посеянным б актер иальным инокулумом, После инкубации в течение ночи при 28 С измеряют в миллиметрах диаметры защитных зон..Проведенные биоиспытания на чашках, засеянных Vibrio percolons (MB-1272) показали, что после 4-дневной ферментации образуются защитные зоны диаметром 31,5 мм.
Отфильтрованную культуральную жидкость подкисляют до рН 7 разбавленной соляной кислотой и 290 мл адсорбируют на
100 мл сильпоосновной анионообменной смолы, имеющей стиролдивинилбензольную матрицу, при расходе 10 мл в 1 мин, Отработанный раствор собирают фракциями по 500 мл.
Смолу промывают водой и элюируют Зо/оным раствором хлористого аммиака в 90 /оном метаноле. Элюат собирают фракциями по 100 мл. Все фракции подвергают биоиспытаниям против Vibrio percolons (МВ127,2, .
Проведенные опыты показали 60 О/о -ную активность в отработанной фракции и 18О/оную активность во фракции алюата. Кроме того, в этих опытах было установлено, что смола адсорбирует только две фракции или
10 объемов бульона. Элюированные фракции 1 — 4 обьединяют и концентрируют, удаляя метанол. Отработанные фракции 3 — б объединяют, получая 1960 мл раствора, подщелачивают разбавленной гидроокисью натрия, доводя рН от 7,2 до 8, и адсобируют на
100 мл сильноосновной анионообменной смолы, имеющей стиролдивинилбензольную матрицу при расходе 14 мл в 1 мин. Отработанный раствор собирают в четыре равные фракции и проводят биоиспытания.
В результате испытаний установлено, что активность этих фракций составляет 5 /о.
Колонку промывают водой и элюир уют
5О/о-ным водным раствором хлорида натрия.
Элюат собирают фракциями по 50 мл и подвергают биоиспытаниям.
Биоиспытания показали, что в объединенных фр акциях 3 — 16 активность составляет 90 .
50 мл полученного концентрата разбавляют до 500 мл, меняя рН от 8,8 до 2 с по мощью разбавленной соляной кислоты, и адсорбируют на 25 мл сильнокислой обменkIoH смолы сульфонатного типа, имеющей стиролдивинилбензольную матрицу (смола
Дауэкс 50;х,2, водородный цикл), при расходе 2,5 мл в 1 мин, Колонку промывают
25 мл воды и затем элюируют 2 -ным пиридином до тех пор, пока рН эфлюента не поднимется до 7 (54 мл) .
Биоиспытания отработанных фракций элюата показали, что отработанные фракции имеют 9 -ную активность, а элюат 90 ную активность. Элюат классифицируют, как пиридиновую соль антибиотика. .Полученный продукт является амфотерным, имеющим изоэлектрическую точку при рН около 3,5. Продукт не устойчив при рН выше 7 и устойчив при рН 1,5.
Полученный элюат подщелачивают до рН
8 разбавленной гидроокисью натрия и концентрируют в вакууме, отделяя пиридин.
446976
Полученный этим способом продукт классифицируют, как мононатриевую соль антибиотика.
Молекулярный вес на основании эмпирической формулы равен 468.
Найдено, о/О. С 39,31; Н 4,76; N 11,16; S
6,46; О 34,12; Na 4,19.
С18Нл N4SOg
Вычислено, %: С 41,0; Н 4,5; N 12,0; S 6,8;
О 30,8; Na 4,9. 10 ,При испытаниях полученного антибиотика было установлено, что он обладает защитными свойствами против следующих грамотрицательных бактерий: Esherichia coli, Proteus vulgaris, Alcaligenes faccalis, Brucella 15
bronchiseptica, Salmonella gallinarum, Vibrio
percolans u Xanthomonos vesicatoria, а также против следующих грам-положительных бактерий: Staphylococcus acereus, Sarcina lutea и Bacillus subtilis 20 .Пример 2. Выращивание культуры проводят как в примере 1, используя на последнем этапе среду следующего состава, r:
Staley s 4S соевой муки 30,0
Перегнанные растворители 7,5 25
Церелоза 20,0
NaC1 2,5
СаСОЗ (рН 7,0) 10,0
Дистиллированная вода 1000 мл
Присутствие антибиотика обнаружено че- 30 рез агар-диффузионное определение, осуществленное на дисках из фильтровальной бумаги 12,7 мм. После инкубации в течение четырех дней, проба бульона дает зону ингибирования 0,33 мм против Vibrio percolans 35 (МВ-1272) .
Пример 3. Лиофилизированной культурой Streptomyces lactamdurans МКК1 3802 инокулируют 50 мл стерильной среды следующего состава, г: 40
Дрожжи
Глюкоза
Фосфатный буфер
MgS04 ° 7Н О
Дистиллированная 45 вода 1000 мл рН доводится до 6,5 с применением NaOH
Состав фосфатного буфера, r:
КН2Р04 91,0
Na НР04 95,0 50
Дистиллированная вода 1000 мл
10,0
10,0
2,0
0,05
Инкубируют при 28 С в течение 72 ч при встряхивании. 10 мл полученной культуральной жидкости инокулируют колбы Эрлен- 55 мейера, содержащие 50 мл стерильной среды, описанной выше, и инкубируют в течение
48 ч при 28 С. Затем содержимым колбы инокулируют ферментатор из нержавеющей стали емкостью 189 25 л, содержащий 160 л 50 среды, описанной выше. Инокулированная среда затем инкубируется при 28 С в течение 48 ч при перемешивании при постоянной аэрации, В течение процесса ферментации прибавляют небольшие количества полигликоля для контролирования вспенивания. 43л инокулянта, полученного в результате выращивания, применяют для инокулирования ферментатора из нержавеющей стали емкостью 757 л, содержащего 467 л стерильной среды следующего состава, г:
Янтарные дрожжи 300 10,0
Перегнанные растворители 20,0
Дистиллированная вода 1000 мл рН 7,0.
Инкубируют при температуре 28 С при аэрации в течение 72 ч.
В процессе ферментации прибавляют небольшие количества противовспенивающего агента, например полигликоля 2000, для предотвращения интенсивного вспенивания.
Отбирают партию и определяют активность при помощи пробы на дисковой пластине.
Бульон от ферментации профильтровывают через диатомитовую землю при рН 7,8 и полученный этим способом продукт идентифицируют как цефамицин С.
Определение на дисковой пластине при разбавлении 1: 10 дает зону ингибирования
21,5 мм против Vibrio percolons (МВ-1272).
Пример 4. Четыре ферментативные партии, полученные согласно примеру 1, адсорбируют на 100 мл сильноосновной анионообменной смоле, содержащей стиролдивинилбензольную матрицу (Дауэкс 1 2 хлоридную циклическую смолу) и элюируют 1%ным водным раствором хлористого натрия.
Этот элюат собирают по фракциям 50 мл и испытывают. Элюированные фр акции из всех четырех партий . доводят до рН 5 при помощи разбавленной соляной кислоты и объединяют, получая 4300 мл раствора.
4200 мл этого раствора перемешивают с 42 г угля (Дарко С-60) в течение 30 мин. Затем уголь отфильтровывают и промывают водой. Фильтрат и промывные воды не имеют активности. Угольную массу дважды промывают порцией по 1 л 60%-ным водным ацетоном при перемешивании смеси в течение 30 мин и каждый раз отфильтровывают, Полученные элюаты концентрируют в вакууме до 108 мл и 100 мл соответственно.
Пробы показали, что первый элюат содержит 76% активности, т. е. в 18 раз активнее исходного вещества, а вторая фракция содержит 17% активного вещества, т. е. в 14 раз активнее исходного вещества.
Эти два концентрата объединяют и концентрируют до 61 мл и доводят до рН 4 — 5 при помощи разбавленной гидроокиси натрия.
Этот концентрат содержит 40 мг/мл сухого твердого вещества и дает 25 мм зону против
МВ-1272 при разбавлении 1: 100 (400 мкг/мл).
Этот продукт идентифицирован, как мононатриевая соль 7 Р-/D-5-амино-5-карбоксивалерамидо/-3-/карбамоилоксиметил/-7- метокси3-цефем-4-карбоновая кислота.
446976
Предмет изобретения
Составитель С. Щенева
Редактор Л, Тюрина Техред H. Куклина Корректор Е. Хмелева
Заказ 2423/7 Изд. Ма 1371 Тираж 456 Подписное
ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий
Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5
Типография, пр. Сапунова, 2
1. Способ получения 7-P/D-5-амино-5-карбоксивалерамидо/- 3 -/карбамоилоксиметил/ - 7метокси-3-цефем-4-карбоновой кислоты (цефамицина С), отличающийся тем, что культуру Streptomyces lactamolurans МЯК1
3802 выращивают в аэробных условиях на среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, при 20 — 37 С и рН среды 6,0 — 8,0 в течение 2 — 4 дней с последующим выделением целевого продукта.
2. Способ по п. 1, отл и ч а ю щий с я тем, что в качестве источника углерода используют углероды, и их концентрация в среде составляет 1 — 6 вес. %.
3. Способ по пп. 1 и 2, отличающийся тем, что содержание источника азота в сре10 де составляет 0,2 — 6 вес. %.
