Способ получения ферментов иммобилизованных в структуре полимеризационных гелей

Союз Соаетсиик

Социаиистичесиик

Реса убттик

ИЗОБРЕТЕНИЯ:

{11) 443902

К АВТОРСКОМУ СВКДИИЛЬСТВУ (61) Зависимое от авт. свидетельства— (22) Заявлено Х3.09. 73{21)I953355f28-Е3 (51) M. Кл.

Гасударственный каинтет

Саавта Мнннстреа СССР аа делам нзабретеннй н аткрытнй

С I2d I3/IO с присоединением заявки (32) Приоритет

Опуоликовано 25.09. 74 Бюллетень Ка 35

Дата опубликования описания I5. I2, 74 (5З) УЛК 577.15 08 (088.83 (72) Авторы изобретения

А.И.Кестнер и М.И.Крезы (71) Заявитель Таллинский политехнический институт (54) СПОСОБ ПОЯУЧИПИ ЭЕРМЕНтОВ жВЮЩПИЭОВЩПЩХ

В CTFPKTFPE ПОИЗПРИМЦИОБНЫХ

ГЕПФ

Изобретение относится к мик- ) робиалогической, медицинской и пищевой промышленности.

Известен способ получения ферментов, иммобилизованных в 5 структуре полимеризационных гелей, путем смешивания раствора ферментов со смесью акриламида и М тн = метиленбисакриламида в присутствии катализаторов радикальной полиме- йо ризации.

С нако при таком способе наблюцается слабое связывание ферментов небольшого молекулярного веса,,цействующих на субстраты с i5 большим молекулярным весом, с гелем.

Прецложенный способ позволяет улучшить связывание ферментов с моледекулярным весом до 50000 с 20 полиакриламидным гелем.

Для этого фермент прецварительно обрабатывают растворами ангидрицов ненасыщенных кислот. Последние целесообразно вводить в такой 25

2 концентрации, чтсбы соотношение

-количества аминогрупп фермента и ангицридных групп кислоты составляло L;(20+40). Из ангидридов ненасыщенных кислот следует использовать ангицриды итаконовой и малеиновой кислот, а обработку ферментов этими растворами целесообразно провоцить при 4 С в течение

Е8-20 час. угицриды ненасыщенных кислот при 4 С в течение Е8-20 час насыщают молекулу фермента иинильными группаии без существенного снижения ферментативной активности.

Ьодифицированные ферменты поцвергают сополимеризации с акрильными мономерами в присутствии катализаторов р цинальной полимеризации. Добавки растворов ангицрицов ненасыщенных кислот к ферментм: улучшают свойства иммобилизованных в структуре полимеркзацис нных гелей ферментов и улучшают структуру еля, делая ее более оцнородной, что

443902 составитель С а Беляев

ТехредКЩЩНДаШОВа Корректор E.ЦЕтрОВа

Редактор А ° Бер

Изд. M 1 5

Тираж $56

Эаказ Я

Подписное

Ц111111П11 Государственного квинтета Совета Министров СССР

ro делам изобретений и открытий

Москва, 13045, Раугнская наб., 4

Предприятие «Патент», Москва, Г-59, Бережковская наб., 24 поцтверщцают оптйческие характерис= тики получаемого геля.

ПримерХ. С целью насыщения фермента винильными группами составляют реакционную смесь из 5 равных объемов раствора трипсина с активностью B E/ìë (определяется по методу Ансона) и раствора ангидрида итаконовой кислоты с концентрацией Ю мг/мл., что соответст-10 вует соотношению амина= и ангицриидных групп I-(20 40 а териостатирувт смесь при 4 С в течение ночи. Активность ферментов поц действием ангидрида кислоты првктически не уменьшается.

Для иммобилизации ферментов составляют полимеризационную смесь следующего состава :7,6 ч. реакционной смеси А,.I,4 ч. 50 ного раствора акриламица и и,й - метиленбисакриламида (в соотношении

90:I03 и 0,5 ч. 5 ного раствора

w, w, л, ю =тетраметилендиамина.

Смесь процувают азотом I5-30 мин ддя25 уцаления кислороца, ингибирующего процесс полимеризации.Затем в смесь добавляют 0,5 ч. раствора надсернокислого аммония и процолжают продувание в течение -2 ваш. В течение зо, I0-I5 час при 4 С образуется довольно прозрачный блок геля, обла.цающий ферментативной активйостью.

Гелевый блок измельчают, многократно промывают буферным раствором и зь определяют активность фермента в промывных водах. В геле фиксируется 70-75> исходного поличества фермента. Активность иммобилизованного ферьжнта составляет 2,5-3 Е/r 4о геля.

Пример 2. Соблюцают условия примера I, но в реакционную смесь

А ввоцят раствор химотрипсина с активностью по АТЭЭ равной 2060 фЪл45

Активность иммобилизованного фермента составляет 323 Е/г геля.

Пример 3. Соблюдают условия примера I, но оеакционную смесь А составляют из раствора химотрипсина с активностью по ATdd равной 4500

Е/мл и раствора ангицрица малеиновой кислоты с соотношением амино= и ангидрицных групп Х:40. Активность иммобилизованного фермента составляет I40 Е/r геля.

I. Способ получения ферментов, иммобилизованных в структуре полимеизационных гелей, путем раствора ермента со смесью акриламида и м, ч -метиленбисакрилащщв;в присутствии катализаторов радикальной гга- лимеризации, отличающийся тем, что, с целью лучшего связывания ферментов с молекулярням весом до 50000,. ферменты предварительно обрабатывают растворами ангицридов ненасыщенных кислот.

2. Способ по и?, отличающийся тем,что используют такие концентрации растворов ангидридов ненасыщенных кислот, чтобы соотношение количества аминогрупп фермента и ангидридных групп кислоты. составляло I:(20-40).

3. Способ .цо пп.I-2, отличающийся тем, «чтб из ангидрйцов ненасыщенных Мйслот используют ангидриц итаконовой кислоты.

4. Способ по пп.I-З, отличающийся тем, что из ангидридов ненасыщенных кислот используют ангидриц малеиновой кислоты.

5. Способ по пп. I-4 отличающийся тем, что обработку фермента растворамй ангидридов ненасыщенных кислот осуществляют в течение

IB-20 час при 4 С.