Способ очистки l-аспарагиназы

<и 436085

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советский

Социалистических

Республик (61) Зависимое от авт, свидетельства (22) Заявлено 07.08.72 (21) 1818995/28-13 с присоединением заявки № (51) М. Кл. С 12d 13/10

Государственный комитет

Соавта Министров СССР по делам изаоретении и открытий (32) Приоритет

Опубликовано 15.07.74. Бюллетень № 26

Дата опубликования описания 18.12,74 (53) УДК 577.15.08 (088.8) (72) Авторы изобретения (71) Заявитель

В. М. Денисов, В. И. Максимов и Г, А. Молодова

Всесоюзный научно-исследовательский институт биосинтеза белковых веществ (54) СПОСОБ ОЧИСТКИ L-АСПАРАГИНАЗЪ1

Изобретение относится к ферментной области микробиологической промышленности и может быть использовано в производстве ферментов из микроорганизмов. Оно решает задачу очистки ферментов, в частности L-аспарагиназы.

Известен способ очистки L-аспарагиназы, предусматривающий приготовление экстракта, добавление стабилизатора, нагревание полученной смеси, удаление выпавших в осадок балластных белков, например, центрифугированием, и фракционное осаждение L-аспарагиназы, например, сульфатом аммония.

В качестве стабилизирующих добавок, применяемых при очистке L-аспарагиназы в известных способах используют глицин, алании или субстратаспарагин, а также полиэтиленгликоль. Этот способ характеризуется низкой степенью очистки аспарагиназы, при проведении которой в качестве стабилизатора используется вещество сложного состава (L-аспарагин); расход этого вещества особенно велик на первых стадиях очистки, где применяют большие объемы жидкости.

Для повышения стабильности L-аспарагиназы предлагается в процессе очистки перед добавлением стабилизатора экстракт подкислять, а в качестве стабилизатора использовать сульфат аммония. Целесообразно экстракт подкислять до значения рН 4,0 — 4,5, например, добавлением уксусной кислоты.

Обнаружено, что в присутствии сульфата аммония L-аспарагиназа в экстракте из ацетонового порошка клеток Е. cali, подкислением до рН 4,5, выдерживает без существенной инактивации нагревание до 55 C в течение 15 — 60 мин, в то время как часть балластных белковых примесей денатурирует, становится нерастворимой и выпадает в осадок, который может быть отделен от раство10 ра L-аспарагиназы центрифугированием. Таким образом, сульфат аммония является стабилизатором L-аспарагпназы, так как без него фермент при этой обработке полностью инактивирустся.

15 Предлагаемый способ заключается в том, что биомассу Е. со11, полученную выращиванием на среде, содержащей белковый гидролизат или кукурузный экстракт, глицерин и минеральные соли, при 37 С обрабатывают

20 ацетоном, сушат и получают ацетоновый порошок Е. coli, из которого водной экстракцией извлекают фермент. Ферментный экстракт подкисляют добавлением СНаСООН до рН

4,0 — 4,5 и отделяют от биомассы любым спо25 собом, например центрифугированием, К супернатанту, представляющему собой раствор

L-аспарагиназы с примесями, добавляют сульфат аммония до 40 — 500/ц насыщения, смесь нагревают до 55 С в течение 15 — 60 мин

30 (предпочтительно 30 мин), выпавший осадок денатурированных белков отделяют любым

436085

15

Таблица

Удельная активность, МЕ/мг белка

Выход Lаспарагиназы, о

Условия обработки экстракта

Исходный раствор (рН 4,5)

Нагревание без сульфата аммония (55 С; 30 мин)

Фракционирование сульфатом аммония (50 — 90", полного насыщения) без нагревания

Повторное фракционирование (50 — 90,, полного насыщения) с нагреванием (55 С; 30 мин)

Одностадийное фракционирование сульфатом аммония (50 — 90; полного насыщения) с нагреванием (55=С;

30 мин) 3,5

5,0 — 6,0

100

70 — 80

15,0

15,0

40

45 способом (фильтрованием или центрифугированием). Получают раствор L-аспарагиназы в полунасыщенном растворе сульфата аммония, очищенный от значительной части балластных белков. Для извлечения из него

L-аспарагиназы добавляют сульфат аммония почти до полного насыщения (90 — 100 ).

Предложенным способом получают L-аспарагиназу с удельной активностью 15—

25 МЕ/мг с выходом 70 — 80% подкисленного экстракта.

Для определения удельной активности

L-аспарагиназы, после очистки ее нагреванием в полунасыщенном растворе сульфата аммония и осаждения ее из раствора, насыщенного той же солью, вещество предварительно очищают от примеси сульфата аммония хроматографией через гель сефадекс G-25. ПоПример 1. 5 r ацетонового порошка

E. co1i смешивали со 100 мл воды и нагревали при 37 С 2 час периодически перемешивая, добавляли 6 мл 1,0 М СНзСООН. Осадок отделяли центрифугированием при

5000 об/мин в течение 30 мин. К 90 мл супернатанта с удельной активностью 3,0 МЕ/мг при постоянном перемешивании добавляли

28,8 г кристаллического сульфата аммония (50 /о насыщения). Осадок отделяли центрифугированием при 5000 об/мин в течение

20 мин. К супернатанту при постоянном перемешивании добавляли 34,2 г кристаллического сульфата аммония (100% насыщения).

Осадок собирали центрифугированием и растворяли в 10 мл воды. К 10 мл полученного раствора при постоянном перемешивании добавляли 3,2 г сульфата аммония. Раствор ставили в водяную баню при 55 С и выдерживали 30 мин, осадок отделяли центрифугированием. К супернатанту добавляли 3,8 г сульфата аммония. Осадок собирали центрифугированием и растворяли в 10 мл воды.

Раствор имел удельную активность

15 МЕ/мг.

Пример 2. 50 г ацетонового порошка

Е. coli смешивали с 1 л воды, нагревали до

35 лучают удельную активность 5 МЕ/мг белка с выходом 70% содержания L-аспарагиназы в исходном экстракте. Активность измеряют по количеству аммиака, освобождающегося при ферментативном гидролизе L-аспарагина и определяемого несслеризацией. 3а единицу активности берут количество фермента, которое приводит к образованию 1 микромоля аммиака за 1 мин при 37 С (международная единица) . Активность определяют в натрий-ацетатном буфере рН 5,0. Белок определяют обычными методами: по Лоури и биуретовым.

В таблице приведены средние результаты, характеризующие влияние нагревания растворов L-аспарагиназы на удельную активность и стабильность.

37 С в течение 2 час периодически перемешивая. После этого к раствору добавляли концентрированную уксусную кислоту до рН 4,5, Осадок отделяли центрифугированием при 5000 об/мин в течение 30 мин. К

0,84 л супернатанта с удельной активностью

6,0 МЕ/мг белка при постоянном перемешивании добавляли 269 г кристаллического сульфата аммония (50О/о насыщения), раствор нагревали до 55 С в течение 30 мин, охлаждали до комнатной температуры и фильтро- вали через бумажный фильтр. К раствору (0,95 л) при постоянном перемешивании добавляли 285 г кристаллического сульфата аммония (90 о/о насыщения) . Осадок собирали центрифугированием при 5000 об/мин в течение 20 мин и растворяли в подходящем буфере.

Удельная активность полученного раствора

26,3 МЕ/мг, выход 75%.

Предмет изобретения

1. Способ очистки L-аспарагиназы, предусматривающий приготовление экстракта, добавление стабилизатора, нагревание полученной смеси, удаление выпавших в осадок бал436085

Составитель В. Максимов

Техред Е. Борисова

Корректор А. Дзесова

Редактор Л. Тюрина

Заказ 3322/7 Изд. № 1814 Тираж 456 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений н открытий

Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Типография, пр. Сапунова, 2 ластных белков, например, центрифугированием, и фракционное осаждение L-аспарагиназы, например, сульфатом аммония, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью повышения стабильности L-аспарагиназы, в процессе очистки перед добавлением стабилизатора экстракт подкисляют, а в качестве стабилизатора используют сульфат аммония.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что экстракт подкисляют до значения рН

4,0 — 4,5, например, добавлением уксусной кислоты.