Патент ссср 412247

 

412247

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К АВТОРСНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советских

Социалистических

Республик

Зависимое от авт. свидетельства ¹â€”

М. Кл. С 12d 13/06

Заявлено 21.11.1972 (Pk 1752613/28-13) с присоединением заявки №вЂ”

Приоритет—

Опубликовано 25.1.1974. Бюллетень № 3

Дата опубликования описания 19.1Х.1974

Государственный комитет

Совета Министров СССР во делам изобретений и открытий

УДК 663.18(088.8) Авторы изоб.ретенля

P. Я. Карклинь, В. Т. Лука, В. К. Гайле, Б. Я. Кестере, С. А. Краукле, А. А. Луриньш, П. А. Станкевич, Я. Т. Степанов и В. Я. Лукшо

Заявитель

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИТАКОНОВОЙ КИСЛОТЫ

0,05

0,1

Изобретение относится к способу получения итаконовой кислоты с помощью микроорганизмов, применяемой для получения полиакрилонитрилового волокна нитрон.

Известен способ получения итаконовой кислоты, предусматривающий .глубинное выращивание посевного материала — культуры

Aspergillus terreus — продуцента кислоты на питательной среде, содержащей углеводы, например пищевой сахар, сахар-сырец, мелассу, кукурузный экстракт, необходимые минеральные соли, основную ферментацию на этой же питательной среде с последующим получением кристаллов итаконовой кислоты из ферментационного раствора (культуральной >кидкости), осветлением растворов активированным углем, фильтрацией, выпариванием и кристаллизацией.

Цель изобретения — увеличение выхода итаконовой кислоты.

Достигается это тем, что из вида terreus используют штамм Г-232, а выращивание посевного материала осуществляют на питательной среде, содержащей преимущественно

3% углевода при рН среды 23 — 2,5.

Основную ферментацию осуществляют при рН-5,5,5, при этом в процессе основной ферментации после разрастания мицелия производят двухкратную подкормку среды (через

2 двое и четверо суток) до концентрации углевода в среде 90 — 100 г/л.

Предлагаемый штамм Г-232 Aspergillus

terreus получают в результате обработки природного штамма 7!8/9 Aspergillus terreus ультрафиолетовыми лучами и этиленимином.

Культурные свойства штамма и характер роста изучались на питательных средах, применяемых для культивирования Aspergillus

1в terreus модифицированной среде МойераКогхила, среде Чапека-Докса, сусло-агаре (солодовой среде), картофеле и специальных средах, используемых для получения итаконовой кислоты.

На модифицированной среде Мойера-Когхила изучалось строение .гигантской колонии на пятые сутки.

Данный штамм имеет следующую характеристику

1. Морфологические свойства.

Модифицированная среда Мойера-Когхила. Состав среды, г:

Лактоза 10

Сахар (песок) 5

Фосфорнокислый калий од поз а м еще и и ьш (К1-1 РО4) 0,06

Сернокислый магш.й (МдЯО,) зп Хлорпстый калий (КС1) 412247

Сахароза 30

Азотнокислый натрий (NaNO-) 2 0

Фосфорнокислый калий двузамещенный (К НР04) 1,0

Сернокислый магний (MgSO4 7 Н О) 0,5

Хлористый калий (КС1) 0,5

Сернокислое железо (FeSO4 . 7 НаО)

Агар

Вода

0,01

20 л до l л.

Субстратный мицелий средней толщины, плотный, складчатый. В начале развития бесцветный, затем бурый со слабожелтоватым оттенком, в субстрате образует черно-коричневый пигмент. Имеется воздушный мицелий.

Конидии песочного цвета.

Сусло-агар (солодовая среда), Субстратный мицелий тонкий, бесцветный. Воздушный мицелий высокий. Конидиальные головки образуются на значительном расстоянии одна от другой.

Картофельный ломтик. Субстратный мицслий средней толщины, плотный, бледно-желтый, немного складчатый, конидии песочного цвета. Имеется воздушный мицелий.

3. Антагонистические свойства.

Aspergillus terreus Г-232 — слабый антагонист в отношении В acterium coli, Bacillus

mesentericus, Bacillus megathericus.

4. Биохимические признаки.

Хлористый натрий (NaC1) 5,0

Азотнокислый калий (KNOa) 3,0

Кукурузный экстракт 1,5

Агар 20

Вода до1л.

У трехсуточной культуры конидиальные головки слегка вытянутой формы, диаметром

27-54 мк. Пузырьки (визикулы) грушевидной формы, диаметром 12-15 мк. 2/3 визикулы покрыты стеригмамн. Стеригмы двуслойные.

Длина стеригм первого порядка 5 мк, второрого — 4 мк. Конидии гладкие, круглые, их средний диаметр 2,2 мк. Длина конидиеносцев 60-105 мк, диаметр 3-4 лтк.

2. Культуральные свойства.

Пятисуточная гигантская колония штамма

Г-232, выращенная на модифицированной среде Мойера-Когхила при 32 С, имеет круглую форму диаметром 4,9 см. Край колонии ровный, субстратный мицелий тонкий, гладкий, в начале развития бесцветный, затем светлокоричневого цвет". Конидиеносцы низкие. Поверхность покрыта конидиальными головками песочного цвета. В центре колонии находится густое конидиеношение диаметром 0,5 см. Наружная сторона колонии шириной 0,3 см аспорогенна. Продолжительность созревания конидий 12 — 14 суток при 29-.30 С.

Модифицированная среда Чапека-Докса.

Состав среды, г:

Селекционированный штамм Aspergillus

terreus Г-232 хорошо сбраживает сахарозу при глубинном способе культивирования.

Активность биосинтеза итаконовой кисло5 ты штамма Г-232 Aspergillus terreus на разных питательных средах приведена в таблице.

Ныход итаконовои кислоты от сахара, 4 (средние данные) Съем итаконовой кислоты, кг/лт в сутки (средние данные) Сырье

17

Сахар нищевои

Сахар-сырец (тростниковый)

Мел асса

16

55

30,0

3,0

2,7

Способ заключается в следующем.

Выращивание посевного материала осуществляют в посевных ферменторах на питательных средах с 3%-ным содержанием углевода, рН среды 5,0-5,5.

Засев питательной среды производят сус25 пензией сухих конидии из расчета 0,7 г конидий на 1 м среды.

Продолжительность цикла выращивания при 34 — 36 С составляет I30 — 36 час. Затем

30 посевной материал в количестве 5 — 10% по объему переносят в основную среду (концентрация углевода 6 — 7%, рН 2,3 — 2,5) для биосинтеза.

Продолжительность цикла основной фер35 ментации 60 — 72 час, При выращивании посевного материала н основной ферментации режим аэрации заклюается в следующих соотношениях: 0,5 объема воздуха на 1 объем питательной среды в лаг40 фазе и 0,8 объема воздуха на,l объем питательной среды в экспоненциальной и стационарной фазах роста. Цикл ферментации заканчивают при содержании неассимилированного в среде углевода 0,1 — 0,2%.

После окончания цикла ферментации мицелий отделяют фильтрацией от культуральной жидкости. Полученный раствор и промывные воды от мицелия осветляют активированным углем, фильтруют и упаривают до ,концентрации итаконовой кислоты 35 — 38%.

Упаренный раствор кристаллизуют и получают «технические» кристаллы с содержанием итаконовой кислоты до 96% .

Для получения кислоты реактивной чистоты требуется двуразовая кристаллизация.

Выход кристаллической итаконовой кислоты составляет 80 — 85% от итаконовой кислоты в ферментативных растворах. В дальнейшем способ поясняется приме60 рами.

Пример 1. Выращивание посевного материала ведут па среде следующего состава, г/л:

Пищевой сахар или сахар-сырец

Сернокислый магний

Азотнокислый аммоний

412247

Предмет изобретения

2,3 не добавляют

Составитель М. Ларина

Техред Т. Миронова

Корректор С. Хейфиц

Рсд".êòoð Г. Мсзжечкова

1210j215 Изд. М 393 Тираж 468 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

> аказ

Тип. Харьк. фил. пред. «Патент»

Кукурузный экстракт: для сахарной среды 6,0 для сахара-сырца 3,0 рН среды 5,0 — 5,5.

1Процесс выращивания осуществляют при температуре 34 — 36 С в течение 30 — 36 час.

Посевной материал в количестве 5 — 10 /о от объема, взятый в конце экспоненциальной фазы роста и содержащий 22 — 24 г/л сухого мицелия, переводят в основную среду для биосинтеза.

Среда для биосинтеза содержит, г/л : Пищевой сахар или сахар-сырец 70 — 80,0

Сернокислый магний 3,0

Азотнокислый аммоний 2,0

Кукурузный экстракт: для сахарной среды для сахара-сырца рН среды 2,3 — 2,5.

После засева среда содержит 2 —,3 г/л сухого мицелия. Биосинтез итаконовой кислоты ведут при температуре l34 — 35 С в течение

60 — 72 час. По истечении этого срока культуральный раствор содержит 30 — 40 г/л итаконовой кислоты, 0,1 — 0,2% неассимилированного грибом сахара, 9 — 11 г/л сухого мицелия.

После отфильтровывания мицелия растворы направляют на химическую переработку.

Пример 2. Мелассная среда для выращивания посевного материала характеризуется следующими показателями, г/л:

Сахар мелассы 30,0

Азотнокислый ам маний 1 — 2 рН 5,0 — 5,5.

Условия выращивания посевного материала аналогичны условиям в примере 1.

Среда для основной ферментации содержит, г/л:

Сахар мелассы 30 — 35

Азотнокислый аммоний 1 — 1,5 рН среды 2 3 — 2,5.

Характерной чертой биосинтеза итаконовой кислоты на мелассной среде является подкормка погруженной культуры в течение цикла.

Обычно осуществляют две подкормки. Первую — на вторые сутки после разрастания мицелия, вторую — на четвертые сутки.

В обоих случаях с целью повышения выхода итаконовой кислоты концентрацию сахара доводят в среде до 9 — 10%. Биосинтез ведут при температуре 34 — 35 С. Продолжительность всего цикла ферментации составляет 6 — 7 суток.

В конце цикла ферментации культуральный раствор содержит 40 — 50 г/л итаконой кислоты.

1. Способ получения итаконовой кислоты, предусматривающий 1глубинное выращивание посевного материала — культуры Aspergillus

terreus — продуцента кислоты на питательной среде, содержащей углеводы, например пищевой сахар, сахар-сырец, мелассу, кукурузный экстракт, необходимые минеральные соли, основную ферментацию на этой же питательной среде с последующим получением кристаллов итаконовой кислоты из ферментационного раствора (культуральной жидкости), осветлением растворов активированным углем, фильтрацией, выпариванием и кристаллизацией, отличающийся тем, что, с целью увеличения выхода кислоты, из вида terr eus используют штамм Г-232, а выращивание посевного материала осуществляют на питательной среде, содержащей преимущественно

3% углевода при рН среды 2,3 — 2,5.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что основную ферментацию осуществляют при рН 5 — 5,5.

3. Способ по п.п. 1 — 2, отличающийся тем, что в процессе основной ферментации после разрастания мицелия производят двухкратпую подкормку среды — через двое и четверо суток, до концентрации углевода в среде

90 — 100 г/л.