Патент ссср 403134
< г -т
О П И С А Н И Е 403I34
Р
Союз Советских
Социалистических
Республик
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
Зависимьш от патента Л
М. Кл. А 61k 23100
А 61j 3/ОО
Заявлено 30.111.1972 (№ 1765402 30-15) Приоритет 12Л .1971, ¹ 31213, Япония
Государственный комитет
Совета Министров СССР оа делам изобретений и открытий
УДК 619.4:616.7.716 (088.8) Опубликовано 19.Х.1973. Бюллетень ¹ 42
Дата опубликования описания 16.111.1974
Авторы изобретения
Иностранцы
Тадаеси Казуга, Ясукие Накасе и Мииору Кавахиро (51 по!i ия ) 1 1110CTр 311113 H ф f l p м 3
«Китасато И иститут» (Япоиия) 3 аявител ь
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ И НАКТИ ВИ РОВАН НОЙ ВАКЦИ Н Ы
ПРОТИВ ИНФЕКЦИОННОГО АТРОФИЧЕСКОГО РИНИТА
СВИНЕЙ
Изобретение относится к способам производства вакциоиы, например, про!ив инфекционного атрофического рииита свиней.
Извсстиы способы получения ииактивированной формалином вакцины против инфекционного атрофического рииита свиней из микроорганизма Bordetella bronchiseptica. Однако указанная вакцина ие давала стойкого иммуиитета.
Предлагаемый способ отличается тем, что для приготовления вакцины используют в качестве исходного материала микроорганизм
Bordetel!a bronchiseptica 1 фазы развития, содержащий К-аитигеп и аитигеи. Культивирование микроорганизма осуществляют в питательной среде с добавлением 0,5 — 1 вес.% казамииовой кислоты, 0,05 — 0,1 вес.% дрожжевого экстракта и 0,1 — 0,5 вес.% порошкообразного активироваииого угля или 0,3—
1 вес.% аиионообмеииой смолы с последующей ииактивацией микроорганизма. Микроорганизм в фазе развития Bordetella bronchiseptica — это граммотрицательиый микроб, обнаруживающий па кровяном агаре коккоподобную или коккобацилляриую форму, имеющую капсулы или оболочки, ие имеющий или имеющий немного жгутиков, облада1ОЩВ11 такими СВ011СТВВI В11сок3 to вирулс! I llocTb при ввс 1еиии в мозг мышей и з113читсльиую искротоксичиость при виутрикожиом Введении морским свинкам. Анти-1(-сыворотка rrpeäñòaâляет собой кроличью сыворотку, полученную адсорбироваии3п см ffilifi fflfsffporrafllloif микроорганизмом в 1 фазе развития Iipo.irr 120 микроорганизма в 1 фазе. 11икрооргаиизм III фазы представляет собой микроор15 гаиизм в 1 фазе, потерявший свои капсулы или ооолочки. Аизи-О-cblBopoTha Ilpeдст
20 cBoffc I Ba. 403134 4 антитела (К-а1питела), способные сильно агглю1инировать микроорганизм 1 фазы (развития) . Для получения инактивироваш1ой вакцины в соо1ве1с1вии с изобретением в качес1ве основной среды используется среда кровяного arapa. Это потому, что наличие или О1сутствие К-антигсна в микроорганизме 13ordeteila bronchiscptica является важным ключом для повышения защитной силы вакцины, а кровь в среде кровяного агара способствует предохранению от исчезновения К-антигена. Однако трудно обеспечить большое количество крови в производстве вакцины. Изучалась возможность применения К-антигенозащитных ма 1ериалов Взамен крови и Окс!Залось, что специфическое сочетание казаминовой кисло1ы, дрожжевого экстракта и активированного угля или ионообменной смолы лучше, чем кровь, и что вакцина, полученная из микроорганизмов, выращенных в среде, содержащей подобное сочетание, оказывает профилактическое (предохранительное) действие. Употребляемое взамен крови сочетание веществ содержит следующие количества компонентов, вес.%: 0,5 — 1 казаминовой кислоты, 0,05 — 0,1 дрожжевого экстракта и 0,1 — 0,5 порошкообразного активированного угля или 0,3 — 1 анионообменной смолы, из расчета веса твердой или жидкой основной среды, например питательного агара или бульонной среды (питательного бульона), Указанное сочетание вносят вместо крови в основную среду питательного агара или бульона. Инактивированную вакцину получают таким образом, что содержащий К-антиген микроорганизмы 1 фазы 13ordetella bronchiseptica выращивают на указанной бульонной или агаровой среде с углем, получая достаточное количество активного вещества, благодаря чему возможно производство вакцины в промышленном масштабе. Полученные клетки убивают или лизат клеток инактивируют путем термическои обработки при 50 — 60 С, используя такие химические вещества, как тимерозал (этилмеркурийтиосалицилат натрия) или формалин, или используя физические методы, например ультразвуковой дезинтегратор илн пресс Френча. Полученная таким способом инактивированная вакцина применяется как таковая или после добавки алюмогеля или масла. Во всех примерах проценты даны в весовом выражении. Пример 1. Содержащим К-антиген микроорганизмом l фазы Ьордетслла бронхисептика засевают (инокулируют) среду, получеш1ую добавлением 0,5 — 1% казаминовой кислоты, 0,05 — 0,1% дрожжевого экстракта и О,!— 0,5% порошкообразного активированного угля и питательный агар (в качестве основной среды), среду, получеппу1о дальнейшим добавлением 0,5 — 1% полипептона в вышеупомянутую среду, или среду, идентичную по составу вышеупомянутой за исключением того, что вме5 65 сто активированного угля дают 0,3 — 1% анионообменнон смолы, и выращивают 48 час при 3(С. Образовавшиеся клетки собирают и 11ереносят в раствор фосфатного буфера с образованием суспензии клеток в концентрации 1 — 200 биллионов/мл. Затем клетки убивают нагреванием суспензии при 50 — 60 C в течении 30 мин или обработкой 0,05 — 1,0 1, формалина или 0,01 — 0,2% тимерозала и обработанную таким образом суспензию вместе с 0,01% тимерозала (в качестве консерванта) используют для получения вакцины. Пример 2. Содержащим К-антиген микроорганизмом Bordetella bronchiseptica засевают среду, полученную внесением 0,5 — 1% казаминовой кислоты, 0,05 — 1,0% дрожжевого экстракта и 0,1 — 0,5% порошкообразного ак1ивированного угля в питательный бульон в качестве основной среды, или среду, идентичную указанной, за искл1очением того, что вместо активирова1шого угля вносят 0,3 — 1% анионообмешюй смолы, и затем культивируют при взбалтывании или без него 48 час при 37"С. Образовавшиеся клетки отфуговывают, и повторяют ту же операцию (что в примере 1) для получения вакцины. Пример 3. В вакцину из примера 1 вносят алюмогель из расчета, чтобы количество ионов алюминия достигало 2 — 10 мг/мл. Вакцину с такой же эффективностью, как вышеупомянутая, можно получить внесением равного количества масла с целью эмульгирования (вместо алюмогеля). П р и м ер 4. Аналогично описанному в примере 2 получают культуральную жидкость путем ипокуляции и выращивания К-антигенсодержащего микроорганизма 1 фазы Bordetella bronchiseptica в жидкой среде и инактивацию полученных клеток производят добавлением 0,01 — 0,02% тимерозала. В культуральную жидкость вносят алюмогель в количестве 2 — 10 мг/мл и оставляют до утра при 4 С, после чего снимают надосадо шую жидкость для получения вакцины в виде геля, на котором адсорбированы клетки указанного микроорганизма и растворимое действующее начало. Пример 5. Полученные в примере 1 или 2 клетки разрушают, подвергая их ультразвуковой обработке или обработке на прессе Френча, вносят 0 01% тимерозала и используют для получения вакцины. Ее можно вводить методом ингаляции. Полученную описанным способом вакцину разбавляют до концентрации, эквивалентной 1 — 200 бил/мл, и 1 — 5 мл разведенной вакцины инъецируют 2 — 3 раза или вводят путем ингаляции в носову1о полость свинок в возрасте 3 — 30 дней с интервалами в 1 — 3 недели, побы обеспечить иммунизацию. Кроме того разбавленную вакцину инъецируют 2 — 4 раза свиноматкам в указанные интервалы и дополнительную инъекцию осуществляют во время беременности с тем, что обеспечить пассивную иммунизацию новорожденным свинкам в эм403134 Таблица 1 Процент извлсчсиия Б. броихиссптика Процси i 17110 1).111 И КО:1ОИ Р;1 1ъОЛ ИИ1>1 Группа Вр.мя инъскции 1 2! 29 18 29, 20 87 78 ! 17 4 0 52 23 21 7 0 63 7 и 21 день после родов 2(и 35 день после родов 7-дневная 21-днсвная Контрольная при употрсблснии вакцин Пр п м с ч а н и е. Цифры в колонках 1 — 4 ир=дставляют рсзультаты, получсниы. полученных соответствснно в примсрах 1 — 1. Таблица 2 Процент извле- Процент атрофии носовой раковины Титр агглютинина I чеиия Б. оронли1 септика у животных в возрастс 3 — 6 месяцев через 4 недели пос1е второй инокуляции Метод инокуляции Группа у животных в возрасте 6 месяцев до второй инокуляции Ингаляция+инъекция Инъскция+инъекция А В Контрольная 50,2 113,0 (5 22,4 22,5 (5 6,3 76,2 33 17 80 бриональпом состоянии. Взрослых свинок можно имму1 изировать, инъенируя 2--3 раза 8 — 10 мл упомянутой разведешюи вакцины с интервалами в 1 — 3 недели. Клинический эффект инактивированных вакцин приводится в 1 пжеслс,1ующих примерах. Пример б. Полученные в примерах 1 — 4 вакцины разводят до концентрации 30 бил/мл. Затем по 1 мл разведенной вакцины вводят внутримышечно соответственно 100 свинкам в возрасте 7 и 21 дня. Через две не,1ели после Пример 7. Подверп1утую ультразвуковой обработке вакцину из примера 5 разводят до концентрации 200 бил/мл. Затем 5 мл разведенной вакцины вводят путем ингаляции через носовую полость каждой из 100 свинок в возрас1е 8 дней, Через 3 недели полученную в примере 3 алюмогельную вакцину, разведенную <о конце1п рации 30 бил/мл, вво;1ят внутримышечно свинкам в дозировке 2 мл (группа Л). Свинкам второй группы (группа В) вводят индивидуально внутримышечно 2 раза с интервалом в 3 недели по 2 мл получеш1ой в примере 3 алюмогельной вакцины, Пример 8. Каждую из полученных в примерах 1 — 4 вакцин разводят до концентрации 30 бил/мл. Затем 3 — 10 мл разведенной вакцины вводят внутримышечно 2 — 4 раза свиноматкам с интервалом в 2 — 4 недели с целью иммунизации. В процессе супоросности ин.ьецируют еще 2 — 3 раза по 3 — 10 мл указанной первой инъекции свш1кам вводят по 2 мл указанной разве.1епной вакц1шы. Через 0 месяцев отмечают клинические симптомы ня свшнсях и сравнивают с контрольными, которых не вакцшшровяли. Изучение клшшчсских симптомов заключается в том, что свинок янатомизиру1от через б месяцев и проверяют атрофию носовой раковины. В табл. 1 приведены полу1снныс результаты. 1 . 1 табл. 1 следу10 ет, что вакцина очень эффск1иilllil и что лучшие рсзультаты полу инп, сслп шп1куляцшо вакцины начинать ня нячялы1ой стадии после опороса. 30 разве,1еннон . .î Iþø;åíòðàïèè 30 бил/мл. Затем сравнивают клинические симптомы у инокулированных свинок и у контрольных, которых не вакцш1ировали. Из приведеш1ых в табл, 2 результатов следует, что даже при введении вяк1пшы методом ингаляции вакцина успешно повышает титр агглютининя и эффективна в отношешш уменьшения атрофии носовой раковины (даже при наличии микробов инокулировянные группы 40 обнаруживают слабые кл1шическис симптомы и невысокий процент атрофии носовой раковины, подобно указанному в примере б). разведенной вакц1шы. Как видно из резуль60 татов, приведенных в табл. 3, новорожденные поросята оказываются высокоиммунпзированными; вакцина эффективна в отношении снижения процента атрофии носовой раковины у таки.; поросят по срявнени1о с поросятами от 65 неинокулировянных контрольiii ix свиномяток, Таблица 3 Новорожденные поросята Св номатки Титр аггil!DTIlaèíà зв 1 недслк> до опороса Положительная стспснь атрофии носовой раковины у одпомссячны; поросят (свинок) Вакцина Кол ичеТитр аггл.отииинв зв 1 иод лю до опороса Доза инъекции, мл Количество инъекций Группа из иримсра l ство! 800 †32 800 — 6400 800 †64 800 — 1 600 9 38 49 1 3 3 4 4 3200 256:0 12800 6400 †128 6400 †128 12800 †256 6400 †128 3 1 3 29 3/10 2 11 1,10 11 Контрольная <50 88 Предмет изобретения Составитель P. Махнюк Редактор В. Хорииа гскрсд T. Ускова Корректор H. Аук Закал 518/19 Изд. ¹ 1015 Тираж 467 . Подписное LIIIHHHH Гoc), aðcòaeííîãо комитета Совета Министров СССР ио делам изобрете.ии1 а о>крытии Москва, Я(-35, Рлугцсквя наб>.,;;. 4/5 Типография, ир. Свпуиовв, 2 1. Способ получения инактивировашгой вакцины против инфекционного атрофического ринита свиней, включающий выращивание микроорганизма на питательной среде с последующим инактивированием его, от гичаюигийся тем, что, с целью получения высокоиммуногенной вакцины, используют в качестве исходного материала микроорганизм Bordetella bronchiseptica 1 фазы развития, содержащий К-агпигсн и анчигсн. 2. Способ по п, 1, orëè÷àþè èéñÿ тем, что выращивание микроорганизма прово,.1>гг на кровяном arape. 3. Способ по и. 1, отличагощийся тем, что в питазельную среду вносят 0,5 — 1 вес.% казаминовой кислоты, 0,05 — 0,1 вес.% дрожже25 ного экстракта и О,1 — 0,5 вес. "/в порошкообразного активированного угля. 4. Способ по п. 1, отлича>оигийся тем, что в питательную среду вносят 0,5 — 1 вес.% казаминовой кислоты, 0,05 — 0,1 вес. /в дрожже30 вого экстракта и 0,3 — 1 вес.% анионообменной смолы. 5. Способ по п. 1, от,гичающийся тем, что шгактивацию осущесч вляют путем термической обрабочки при 50 — б0 С. 35 6. (пособ по и. 1, отличающийся тем, что Ииаг>П ИВаннгО ОС> ЩССЧ ВЛЯЮт П1МЕРОЗаЛОМ ИЛИ формалином. /. Способ по и. 1, от гичаюигийся тем, что инакзивацию ос1щесзвлягот с помощшо 3B)40 кового дезигпсгрьпорa или пресса Френча.
