Патент ссср 400116

 

400И6

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К ПАТЕНТУ

Союз Советских

Социалистических

Республик

Зависимый от патента ¹

М, Кл. С 12Л 13/10

Заявлено 14.1.1970 (№ 139419G/28-13) Приоритет

Государственный комитет

Совета Министров СССР па делам изобретений и аткрытий

Опубликовано 03.Х.1973, Бюллетень ¹ 39

УДК 577.15.07(088.8) Дата опубликования описания 5.II.1974

Авторы изобретения

Иностранцы

Муцуо Симамура, Шуньичи Онума и Хидео (Япония) Иностранная фирма

«Годо Шусэй Кабусики Кайша» (Япония) Амано

Заявитель

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЩЕЛОЧ НОЙ П РОТЕАЗЫ

Изобретение относится к микробиологической промышленности.

Известен способ получения щелочной протеазы путем культивирования Bacillus licheniformis на питательной среде, содержащей источники углевода, азота и минеральные соли, при щелочном значении рН с последующим выделением фермента из культуральной жидкости.

При известном способе щелочная протеаза проявляет свою активность при значении рН

6,0 — 10,7.

При предлагаемом способе щелочная протеаза является типичной щелочной протеазой субтилизированного типа, которая проявляет оптимальную активность при значении рН

10,0 — 10,5 и не теряет свою активность при воздействии хелатирующего вещества (этилендиаминтетрауксусной кислоты ЕДТА), а подвергается воздействию диизопропилфторфосфата (ДЕР) .

Предлагаемый способ получения щелочной протеазы осуществляют путем использования штамма Bacillus licheniformis АТСС № 21471 или его мутантов, например VI — 25 № 202, 82, 82 — 44, 82 — 44 — 02.

Предлагаемый .штамм бактерий выращивают на обычных для бактерий питательных средах при 30 — 35 С в течение 40 — 72 час, включающих глюкозу и крахмал в качестве источштка углевода, пептон и казенн в качестве источника азота и минеральные соли.

Кроме того, в среду добавляют такие вещества, как дрожжевой экстракт нлп экстрлкт из обезжиренного соевого шротл и отрубей.

Пример 1. Bacillus lichenitormis ннкубируют в 1:I жидкой культуральной среды (рН 7,2), содержащей, ф>. глюкозы 1, пептона 1, дрожжевого экстракта 0,1, хлорида нат10 рия 0,2, хлоридл кальция 0,2, фосфата калия

0,05, сульфата млпшя 0,01 и сульфата железа и сульфата марганца по 0,001.

Bacillus lic!)eniforn>is выращивают при встряхивании в течение 72 час при 30 С. По15 лученный бульou содержит алкалиновую протеазу, обладающую активностью 1,930 ед на

1 мл. Бульон культуры дебактеризуют с помощью центрифуги или фильтрл, после чего фильтрат смешивают с 0,8", „-ным насыщсн20 HbIM раствором сульфата аммония, и смесь подвергают высаливанию и диалнзу. Диализованный раствор пропускают через колонку, заполненную диолитовой смолой Л-2 (или анионообменной смолой) для удаления окра25 шивающих веществ. Обссцвеченшяй раствор подвергают колончатой «роматографш1, используя карбоксиметнлцеллюлозу и ДЕЛЕСерадекс, а затем сырую протеазу отделяюг посредством гель-фильтрования, применяя

30 Серадекс-75. Затем сырую протеазу подвер400116 гают оса>кдению с применением ацетона для получения очищенной протеазы, после чего высушивают и измеряют, взвешивая 47 мг высушенной протеазы, имеющей активность

4,110 ед/мг.

Пример 2. Bacillus lichcnifo!mis инкубируют в 1 л жидкой культуральной среды (рН 7,2), содержащей экстракт, полученный экстрагированием обезжиренных соевых лепешек с 4% uûì алкалиновым раствором.

Растворимый крахмал (1%) и Bacillus licheniformis куль гивируют в Лаг-фермснтаторс в течение 40 час при 35 С при аэрации и персмешивании. Полученный бульон культуры содержит алкалиновую протсазу, имсющу!o активность 4,400 сд. на 1 мл. Бульон обрабатывают так >кс, как и в примере 1, дав 1,07 г очищенной высушенной протеазы с активностью 4,110 ед/мг.

Характеристика штамма Bacillus 1icheniform.

Бактериологические свойства.

Растительные палочки (микробы) размером

0,6 — 0,8+1,5 — 3,0 мк, нс в виде цепочек, без капсулей или теневых форм. Подви>кные.

Грам-положительны. На глюкозном питательном агаре палочки (микробы) такие жс, что и на питательном агаре, и содср>кат немного жировых шариков (глобул) . Спорангии — нс четко набухшие, напоминают палочки (микробы) с биполярным окрашиванисм.

Споры размером 0,6 — 0,9;х,1,0 — 1,5 мк, овальной или цилиндрической формы, центральные или парацентральные, тонкостешп.!с, многочисленные за 48 час при 37 С.

Колонии «а питательном агарс — грубая поверхность, волосатые отростки, рост культуры микробов на поверхности. В условиях косого агара — обильный рост, грубая поверхность полупрозрачная, рост культуры по поверхности, поверхность матовая, волосатые отростки.

Питательный бульон — прозрачные с тяжелой, морщинистой плотной оболочкой.

Культура микробов, полученная уколом в желатину, как питательную среду, — быстрое разжижение с переходом из бокалообразных форм в слоистые.

Питательный бульон с )х!аС1 — хороший рост в 5 — 8%-íîì растворе NaCl, отсутствие роста в 12%-ном растворе ХаС1.

В условиях питательной среды из глюкозы и косого arapa — тяжелый рост, складчатость, морщинистость, выдавленные капельки и слизистый.

В условиях питательной среды из п!розина и косого агара - рост такой жс, что и на питательном агаре.

1р

Использование цитрата — положительно.

Картофель — рост тяжелый, распространяются по поверхности, морщинистые, выдавленные, бородавчатые капельки, розовые, красныс и бу рыс на погру>ксцно!! до,!с hap тофсля.

В условиях питательной среды из соевых бобов и косого агара — рост более мягкий и более обильный, чем на питательном arape, цвет от буроватого до красноватого, выдавлс!шыс капельки.

В ус loBHax нитрата глюкозы и косого агара — рост медленный, волосистые отростки, 25 впоследствии рост от умеренного до обильного.

Гидролиз крахмала — положительный.

Продуцирование ацетилметилкарбинола положительное (32 С) рН питательного бульчр она с глюкозой — рН 5,6 за неделю.

Ферментационный тест (опыт сбраживания) — кислота без газа из арабинозы, ксилозы, глюкозы, сахарозы или маннитола (за

14 дней).

З5 Гндролиз казсина — положительный, узкая зона осветления.

Гидролиз >кслатины — положительный, широкая зона гпдролиза. Восстановление нитрата в нитрит — положитсльнос. Анаэробный

4р рост в питательном бульоне из глюкозы положительный, рН 5,2 через 14 дней, получается очень малое количество газа.

Температуры для роста — хороший рост

45 при температуре от 32 до 45 С.

Морфология мутантов существенно пе отлича!отея от основного штамма.

В данном способе могут быть использовацы следующие мутанты из Bacillus licheIii5р formis АТСС 21471 (см. таблицу) .

400116

Протеазная активность, ед, мл

Мутанты

Стойкость фага

Способ вариации

Облучение УФ-лучами

Заражение фагами VI — 25

То же

VI — 25

6,750

6,800

6,860

6,800 (†)

Лп — 8 № 202 № 82

Лп — 1; — 2,— 7 № 82 — 44

Заражение фагами № 82

Лп — 1,— 2,— 3,— 4,— 5, — 6,— 7,— 9

Заражение фагами № 82 — 44

То же № 82 — 44 — 02 № 82 — 44 — 05 № 82 — 44 — 18 № 82 — 44 — 19

Лп — 1 по — 9

То же

¹ 82 — 44 20 № 105

Заражение фагами VI — 25

То же

Лп — 1,— 2,— 7

То же № 119

Естественная вариация № 170

То же

Предмет изобретения

Составитель М. Ларина

Техред Т. Ускова

1(орректор О. Тюрина

Редактор А. Бер

Заказ 182/7 Изд. № 106 Тираж 467 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Минисгров СССР по делам изобретений и открытий

Москва, 3(-35, Раушская наб., д. 475

Типография, пр. Сапунова, 2 № 122 № 126

¹ 167 № 170 № 170 — 04 № 170 † № 170 † № 170 — 13

Способ получения щелочной протеазы путем культивирования Bacillus licheniformis на питательной среде, содержащей источники углевода, азота и минеральные соли, при ще6,780

6,850

6,750

6,780

6,810

6,500

6,570

6,550

6,700

6,800

7,200

7,500

7,800

7,600

7,900 лочном значении рН с последующим выделением фермента из культуральной жидкости, отличающийся тем, что используют штамм

Bacillus licheniformis АТСС № 21471 или его мутанты, например, Vl — 25, № 202, 82, 82—

44, 82 — 44 — 02.