Патентно-- ^ т>&л1}1чеп;д^ 5 f::5a^oycka

 

328604

О Г1 И С А Н И Е

ИЗОБРЕТЕН Ия

К ПАТЕНТУ союз Советских

Ссдиалистических

Республик

Зависимый от патента №

М. Кл. G Oln 21/22

Заявлено 24Х11.1968 (№ 1260079/23-4)

Приоритет 26Х11.1967, № 656032, США

Комитет по делам наобретений и открытиИ при Совете Министров

СССР Д1 543 42 062(088 8) Опубликовано 02.!1,1972. Бюллетень ¹ 6

Дата опубликовяllия 0.1! Iсания 29.111.1972

Авторы изобретения

Иностранцы

Вильям Дрелл и Перси Луис Гербер (Соединенные Штаты Америки) Иностраппа» фирма

«Смит Клайн энд Френч Лабораториз» (Соедине1ьпые IIITBTbl Америки) Заявитель

СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЭТИЛОВОГО

СПИРТА В ТКАНЯХ ЖИВЫХ ОРГАНИЗМОВ

Известный способ количественного определения этилового спирта в тканях живых организмов состоит в обработке исследуемых материалов смесью, в которую входят никотинамиддодениндинуклеотид (НАД), алкогольдегидрогипаза (АДН), буффер, реагент основного характера, стабилизатор, а также агент, связывающий альдегид, например семикарбазид.

Фер ментативный метод основан I!a следующей химической реакции:

С НзОН+НАД СНзСОО+ НАДН+ 1-1+.

Превращение спирта в ацетальдегид идет до конца при условии, что последний продукт связывается и реакция осуществляется в щелочном растворе. В присутствии адекватных количеств алкогольдегидрогиназы (АДН) эта пол окисляется в ацетальдегид с образованием восстановленного НАД, который поглощает свет при длине волны 340 лтл1к. Измерение количественного изменения в поглощении светя позволяет вычислить количество спирта, превращенного за время анализа, и таким образом определить его концентрацию.

Ранее используемые агенты для связывания

НАД, например семикарбазид в виде соли хлористоводороднои кислоты (ХН вЂ” СО— — ХН вЂ” ЫНз НС1), имеют тот недостаток, что они образуют комплексы с НАД, которые впоследствии препятствуют фермснтативному 011ределегппо в связи с тем, что комплексы могут портиться при старении, давая неправильные фотометрические показатели.

5 С целью устранения указагиюго недостатка, а также сокращения времени анализа и повышения его точности, предлагается в качестве агента, связывающего альдегид, применять ямипооксиалкаиовыс кислоты, 1 .Оторые имеют

10 от 2 до 5 атомов углерода, или аминооксиалкансульфокислоты, имеющие до 4 атомов углерода.

Скорость переходя водорода в реакции НАД с этанолом является функцией нескольких

15 факторов в реакционной смеси. Когда все факторы присутствуют в оптима )bllblx количествах, эта скорость зависит прежде всего от скорости удаления ацетальдсп!да. Реакция проте1 ает медлoIIIю, когда В качестве ул Iâ Ill âÿþùå

20 го агента используется семпкарбазид. Время до конца реакции с семикарбазидом составляет 30 — 60 1шн. Обнаружено, что аналоги гпдроксилампна способствуют значительно более быстрому протеканию реакции. Например, в

25 реакционной смеси, содержащей 0,035 л1оль аминооксиуксусной кислоты, реакция идет 5—

15 л1ин в зависимости от количества присутствующего этанола. В этом и состоит преимущество предлагаемого способа — сокращение

50 времени реакции без потери точности, особеп328604

15

25

Всего 1039,6 но тогда, когда требуются частые и быстрые анализы спирта.

Алкогольдегидраза (АДН) является одним из менее стабильных энзпмов, поэтому лиофил??зация энз??:??а обязательна.

С T cl б li л ?l 3 а ?! ?? я э fl 3 ?? ??l cl.

У??с??ьше ше потери активности до минимума во время лиофилпзации и после достигается суспепдпрованпем кристаллического энзима в растворе, который содержит стабилизирующ»е и актпвирующие вещества, например:

Вода, л?г 100

Камедь акации, г 5,0

Никотпнамид — аденпновый динуклеотид, л?г 15

Хлоргидрат цистеина, л г 50

Глицин, г 1,5

Альбумин, г 1,0

Трис-версоловая буфферная смесь при рН=8, мл 5,0

Алкогольдегидр аза 100000.

Данный раствор тщательно сушат прп температуре ниже 0 С и затем переносят в обезвоженную атмосферу. Потеря активности при этом составляет меньше 10 о .

Предпочтительными агентами, связывающими альдегид, являются аминооксиалка новые кислоты, особенно аминооксиуксусная кислота.

Онп очень устойчивы при однородном смешении с реактивными компонентами. Кроме того, найдено, что аминооксиалкаповые кислоты можно использовать в более широком диапазоне концентраций по сравнению с семикарбазидом.

Реактив, применяемый для анализа этанола в тканях живых организмов, состоит из сухой смеси следующих веществ:

Энзим алкогольдегидраза

Буфферная смесь пирофосфат, соль щелочного металла

Стабилизатор глицин и альбумин

Агент аминооксиуксусная улавливающий кислота нейтрализующий карбонат натрия

Коэнзим никотипамид-адениновый динуклеотид.

Первая стадия приготовления реактивной смеси заключается в определении количества нейтрализующего агента, например карбоната натрия, нужного для нейтрализации кислотности новых улавливающих агентов. С этой целью готовят две смеси, которые включают следующие химические вещества, мг:

Высушенный пирофосфат натрия 400

Аминооксиуксусная кислота 200

Глицин 100

Альбумин 27.

Каждую смесь растворяют в 27 мл дистиллированной воды и определяют количество безводного карбоната натрия, необходимое для доведения раствора до рН 8,8 — 9,2. Затем

65 это количество карбоната натрия добавляют ко второму раствору и снова измеряют рН с целью проверки. Количество безводного карбоната натрия, обычно требуемое для получения необходимого интервала рН, составляет около

280 мг для вышеописанной смеси.

Вторая стадия состоит в определении алкогольдегидразы, которую вводят в объединенный реактив. Это определение можно сделать любым методом, описанным в литературе, причем активность АДН устанавливается в международных единицах (М. Е.) на 1 л г лиофилизированного энзима. Необходимо такое количество энзильного препарата, которое бы обеспечивало активность порядка 200 М.

Далее готовят опытную партию в зависимости от количества карбоната натрия и АДН, определенных вышеуказанным способом. С этой целью в сухом виде смешивают следующие ингредиенты (их однородность достигается размалыванием), мг:

Пирофосфат натрия 400

Аминоксиуксусная кислота 200

Глицин 100

Альбумин 27

Ллко гол ьдегидр аз а (200 М. Е./мг)

Никотинамидадениновый динуклеотид 31,6

Карбонат натрия 280

Для подтверждения пригодности данной смеси для анализа этилового спирта в биологических жидкостях часть порошка весом 110—

120 мг полностью растворяют в 2,6 мл дистиллированной воды в оптической кювете со световым пробегом 1 см. Для того чтобы установить уровень активности, создаваемой самими реактивами, т. е. реактивной пробой, кювету помещают в фотометр, допускающий измерение поглощения света при длине волны

340 ммк, Поскольку реакция прекращается, когда все вещество (а именно спирт) прореагировало, нет необходимости поддерживать постоянной температуру в кювете.

Однако для качественного контроля при производстве данного продукта полезно сравнивать активности различных партий при одной и той же температуре. Для аналитических целей выбирают температуру 30 С, хотя можно использовать любые температуры между 25 и 37 С. Кювету, содержащую реактивный раствор, оставляют в фотометре, и измеряют поглощение п Р и 340 лл к 30 л ин с интервалами 5 мин. Удовлетворительная реактивная смесь будет показывать поглощающую способность, которая увеличивается со скоростью не больше, чем 0,001 в 1 мин для пробы.

Далее реактивную смесь испытывают с помощью анализа эталона этилового спирта.

Эталон представляет собой абсолютный этиловый спирт, разбавленный дистиллированной водой до концентрации около 0,2 вес. /oR åì.

Для анализа стандартный раствор этанола

328604

Предмет изобретения

Составитель H. Антипова

Текред Л. Куклина

Корректор Л. Царькова

Редактор Л. Ильина

Заказ 547/17 Изд. ЛЪ 200 Тираж 448 Подписное

ЦНИИПИ Комитета по делам изобретений и открытий при Совете гМинпстров СССР

Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4,5

Сапунова, 2

Типография, пр. разбавляют 49 частями дистиллированной воды. Порцию реактивного порошка весом 110—

120 мг растворяют в 2,7 мл дистиллированной воды для использования в качестве реактивной пробы. Вторую порцию 110 — 120 мг растворяют в 2,6 лгл дистиллированной воды. Разбавленный спиртовой стандарт (0,1 мл) добавляют к последнему раствору, смешивают и оставляют стоять около 5 мин. Фотометр устанавливают па пуль, снимая показания на месте с реактивной пробой. Затем измеряют поглощение стандартного раствора. Эти стадии повторяют с интервалами 5 мин до тех пор, пока два последовательных показания стандарта не будут отличаться на 0,005 или меньше.

Обычно реакция заканчивается за 10 лигг.

Конечное показание поглощения является численно равным содержанию спирта в весовых— объемных процентах. Выход спирта должен быть 100+ 10/ добавленного количества для удовлетворительного анализа.

Окончательно реактив готовят из двух смесей следующего состава, г:

Первая смесь высушенный пирофосфат натрия 400 аминооксиуксусная кислота 200 карбонат натрия безводный 280

Вторая смесь глицин альбумин алкогольдегидраза лиофилизированная 1.

Оба порошка затем объединяют и смешивают для получения гомогенной смеси. Количество данного порошка (1,1 г) растворяют в

30 мл дистиллированной деионизированной воды и измеряют рН. Для данного анализа удовлетворительным интервалом рН является 8,8—

9,2. Активность раствора устанавливают с помощью анализа спиртового стандарта, как описано выше. Законченный реактив в сухом порошкообразном виде готов для упаковки в единицы, каждая из которых обеспечивает все реагенты, необходимые для одного анализа спирта, при растворении в 2,6 лл воды.

Пропорции или количество компонентов реактива, предназначенного для использования, можно изменять, так как изобретешге скорее включает новое сочетание ингредиентов, чем какие-либо критические пределы. АДН, например, должна присутствовать в количестве, до5

Зо

35 статочном для окисления всего спирта, который необходимо определить. То же самое относится к другим компонентам реактива.

Ферментативную оценку спирта можно применить ко всем тем системам, которые содержат или выделяют этанол, не тормозят активности АДН или не препятствуют поглощеншо света при длине волны 340 гидгк. Так, данный анализ можно использовать прп оценке активности трипспна. Трппспп гпдролпзует субстрат — бензоил-аргпнпнэтпловый эфир. Скорость выделения спирта, измеряемая по реакции АДН, будет мерой. активности трипсина.

Аналогичным образом может определяться а«тивность других энзимов, таких как протеазы или эстеразы, которые выделяют этанол, пропанол или бутанол.

Аминооксисоединения, например аминоокспуксусная кислота, также имеют значение как агенты, связывающие альдегид и в других ферментативных анализах. Конкретным примером является определение молочной кислоты, Когда объединяют лактат дегидразы, НАД и аминооксиалкановую кислоту с подходящим буферным раствором, стабилизатором и нейтрализующим агентом, как описано выше, получают удобный реагент для количественного определения молочной кислоты. Аналогично можно анализировать Р-оксимасляную кислоту замещением Р-оксибутирата дегидразы вместо

АДН.

Все варианты анализа, согласно изобретению, включают превращение коэнзпма из одной формы в другую, что сопровождается оптическим поглощением при определенной длине волны.

Способ количественного определения этилового спирта в тканях живых организмов обработкой исследуемого материала смесью пз никотинамиддодегпшдпнуклеотида, алкогольдегидрогиназы, буффера, реагента основного характера, стабилизатора, связывающего альдсгид агента с последующим спектрофотометрическпм анализом, отличающийся тем, что, с целью сокращения времени анализа и повышения его точности, в качестве связующего альдегпд агента берут аминоокспалкановые кислоты, имеющие от 2 до 5 атомов углероды, пли аминоокспалка сульфокислоты, имеющие до 4 атомов углерода.