Н. л. о. п. шарипо и ф. ю. рышка
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ
257I24
Союз Советских
Социалистических республик
Зависимое от авт. свидетельства №
Кл. 421, 3/01
Заявлено 01.VI.1968 (¹ 1246673/23-4) с присоединением заявки ¹
Приоритет
Опубликовано 11,Х1.1969. Бюллетень ¹ 35
Дата опубликовасиия описания 14.1Ч.1970
МПК G 01п
УДК 543.865.07(088.8) Комитет по делам изобретений и открытий при Совете Министров
Слер
Лвтсры изос ретения Р. Г. Виноградова, Н. H. Чамин, А. Л. Бялый, Н. Л
О. П. Шарипо и Ф. Ю. Рышка хт; «:, 1„, :<.. с.!
М,.,:,; ;::! оростроенйя
ФЖм„ЩтрTg y $
Заявитель Специальное конструкторское бюро анапитического при
АН СССР
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ
АМИНОКИСЛОТНЫХ ОСТАТКОВ В ПЕПТИДНЫХ ЦЕПЯХ
Известен способ определения последовательности аминокислотных остатков в пептид— ных цепях, заключающийся в том, что дициклогексилкарбадипмидные производные анализируемого пептида сочета!от с полимером-носителем с последующим определением методом последовательного отщепления аминокислотных остатков. Однако такой споcîá не позволяет анализировать высокомолекулярные пептиды ввиду высокой степени сшиваемости синтетического полиъ(ера-Hi. ñ !Teëë, а так>1(е ввиду того, что ароматические аминокислоты имеют высокое сродство к полимеру-носителю.
С целью создания возможностей для анализа высокомолекулярных пептидов, в качестве полимеров-носителей предложено брать линейный природный полимер, например аминоэтилцеллюлозу и-аминобе!сзилцеллюлозу, а в качестве производных пептидов их фенилтиокарбамилпроизводные.
Пример. Определение аминокислотной последовательности пептидных цепей. Фенплтиокарбамилпроизводное пептида получают по известному методу (например, по способу
Ларсена). 20 !тг фенилтиокарбамилпептида растворяют в 3 .ил абсолютного тетрагидрофурана. В реакционную смесь добавляют 0,4 г аминоэтилцеллюлозы с обменной емкостью
О,б мл . экв/г, приготовленной взаимодействием целлюлозы с эпихлоргидрином в щелочной среде. Раствор охлаждают до — !О С и медленно добавляют 1 л!л 2!/с-ного раствора дициклогексилкарбадпимида в пирпдине. Реакционную смесь перемешивают в течение 1 час при — !О С, а затем еще 30 мин при комнатной температуре, После окончания реакции побочный продукт — дициклогексплмочевину удаляют из реакционной среды декантированием, используя для эгого тетрагидрофуран.
Осадок, освобожденный от дицпклогексилмочевииы,промывают раствором 5",„NaHCO> с Ха СОз, взяты., в соотношении 3: !.
Приготовленное таким способом соединение пептида с полимером, как правило, из!еет большое колпчество в полимере незамен енных аминогрупп, присутствие которых заметно снижает эффективность ступенчатого расщепления. Для блокирозания их ф нилтиокарбамилпептид, соединенный с полимером, суспендируют в трех об.ьемах этилового спирта, подщелоченного до рН9. и смешивают с одних! объемом
1 -ного раствора динитрофторбензола. Сус. пензию перемешивают в течение lac, а затем отфильтровываюl и многократно промывают диэтпловым эфиром.
Промытый осадок 72 л!г помещают в колонку и подвергают ступенчатому расщеплению по следующей методике.
Колонку с анализируемым образцом термозо статируют при 50 С, а затем промывают
257! 24
Предмет изобретения
Составитель Е. Устинова
Редактор Л. Г. Герасимова Техред Л. В. Куклина Корректор Г, С. Мухина
Заказ 696/12 Тираж 480 Подписное
Ц11ИИПИ Козштета по делам изобретений и открытий при Совете Министров СССР
Москва 7К-35, Раушская наб., д. 4/5
Типография, пр. Сапунова, 2
2,5 мл нитрсметана, насыщенного хлористым водородом, или 2,5 мл ледяной уксусной кислоты, также насыщенной хлористым водородом. Скорость пропускания раствора подбирают таким образом, чтобы весь цикл промывки составлял 30 — 40 мин. При воздействия безводной сильнокислой среды происходит отщепление аминокислотного остатка, соединенного с фенилизотиоцианатом, с последующей рекомбинацией в фенилтиогидантоиновое производное аминокислоты. Промывные воды с растворенным фенилтиогидантоином собирают и в них идентифицируют природу аминокислотного остатка известным методом хроматографии или при помощи тонкослойной хроматографиии.
Уменьшенный на один аминокислотный радикал пептид, соединенный ковалентно с носителем, промывают, не извлекая из колонки, вначале этиловым спиртом, а затем водным раствором коллидина, кислотность которого откорректирована до,рН 9.
После промывки через колонку пропускают
50 мл 1%-ного раствора фенилтиоизоцианата в этиловом спирте, подщелоченного органическими основаниями до рН 9. Скорость пропускания через столб сорбента составляет 10—
12 мл/час. После окончания проведения сочетания фенилизотиоцианата с укороченным пептидом содержимое колонки промывают в течение 10 мин 20 мл бензола, а затем 2 м. нитрометана.
Способ определения последовательности аминокислотных остатков в пептидных цепях путем сочетания производных анализируемого
15 пептида с полимером-носителем с последующим последовательным отщеплением аминокислотных остатков по Эдману, отличающийся тем, что, с целью создания возможностей для анализа высокомолекулярных пептидов, в ка20 честве производных пептидов берут их фенилтиокарбамилпроизводные, а в качестве полимера-носителя — природный линейный полимер, например аминоэтилцеллюлозу, п-аминобензилцеллюлозу.
