Цитомодулирующие липофильные пептиды для модуляции активности иммунной системы и подавления воспаления
Изобретение относится к олигопептиднам, включающим аминокислотную последовательность B-X-X-X-B-X-X-X-J-Tyr, в которой В - Lys или Arg; X представляет собой любую аминокислоту, иную, чем заряженная алифатическая аминокислота, или ее D-изомер; J - Gly, Lys или Arg; указанные аминокислоты представляют собой существующие в природе L-изомеры, их D-изомеры и норлейцин, и где указанный олигопептид включает иные, чем (а) встречающаяся в природе последовательность -домена антигена-В лейкоцита человека (HLA-B) 75-84, (б) встречающаяся в природе последовательность трансмембранной последовательности
-цепи Т-клеточного рецептора человека и (в) последовательность, являющаяся мутантной по отношению либо к (а), либо к (б), имеющая не более двух мутаций в качестве активной части указанного олигопептида; способу подавления активации лимфоцитных клеток, способу трансплантации донорных органов или клеток млекопитающих, способу ингибирования синтеза белка воспалительного цитокина клетками, способными продуцировать указанный белок воспалительного цитокина, способу подавления воспалительной реакции у млекопитающих, способу модуляции активности гемсодержащего фермента и способу задержки наступления аутоиммунной болезни у млекопитающего. 7 с. и 29 з.п. ф-лы, 3 табл., 2 ил.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ Данное изобретение относится к области химии и медицины, более конкретно к новым пептидам, полезным для модуляции активности клеток иммунной системы и для подавления воспаления.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ Иммунная система представляет собой чрезвычайно сложную комбинацию клеток и композиций, которая защищает хозяина, представляющего собой млекопитающего, от широкого разнообразия патогенов, и в то же время осуществляет контроль в его теле за вредными аберрациями, такими, как новообразования. Одна ветвь иммунной системы включает клетки, которые осуществляют функции иммунной системы, (а) лимфоциты, такие, как происходящие из костного мозга В-лимфоциты и происходящие из вилочковой железы клетки Т-лимфоциты и клетки, являющиеся естественными киллерами (NK), и (б) одноядерные фагоциты, включающие как моноциты, так и макрофаги. В то время, как лимфоциты в первую очередь связаны со специфическими иммунными реакциями, благодаря их способности специфически распознавать и отличать антигенные детерминанты, одноядерные фагоциты чаще всего осуществляют общее удаление чужеродных микроорганизмов посредством фагоцитоза, а также синтез и выделение цитокинов, что индуцируется либо непосредственно самим микроорганизмом, либо в ответ на стимулированные антигеном Т-лимфоциты. Функции лимфоцитных клеток и одноядерных фагоцитов тесно связаны и имеют важное значение для правильного функционирования иммунной системы. Одной из важных субпопуляций лимфоцитных клеток являются Т-лимфоциты, которые получили свое название из-за того факта, что они вырабатываются тимусом (вилочковой железой). Т-лимфоциты представляют собой группу клеток, включающую комплекс различных клеток, которые могут быть цитотоксическими, обладающими многочисленными механизмами, вызывающими гибель клеток, или активирующими, путем синтеза различных цитокинов, функция которых заключается в активировании других клеток. Цитотоксические Т-лимфоциты (ЦТЛ) действуют, будучи ограниченными конкретным антигеном главного комплекса гистосовместимости (ГКГ), и экспрессируют Т-клеточный рецептор клеточной поверхности, который включает как







Gly, Ala, Val, nL, Ile, Leu,
(б) полярные алифатические:
(1) незаряженные
Cys, Met, Ser, Thr, Asn, Gln,
(2) заряженные:
Asp, Glu, Lys, Arg,
2. Ароматические
Phe, His, Trp, Tyr
в которых Pro может быть включен в неполярные алифатические аминокислоты, но обычно не включен в них. nL означает норлейцин, в котором неполярные алифатические аминокислоты могут быть замещены другими изомерами. Предпочтительно, чтобы по меньшей мере 3 из шести аминокислот, обозначенных как Х в пептидной последовательности B-X-X-X-B-X-X-X-J-Tyr, представляли собой алифатические аминокислоты, содержащие от 5 до 6 атомов углерода, более предпочтительно, чтобы по меньшей мере 4 аминокислоты представляли собой алифатические аминокислоты, содержащие от 5 до 6 атомов углерода, более конкретно 6 атомов углерода. Другие аминокислоты могут представлять собой другие незаряженные алифатические аминокислоты, в частности неполярные алифатические аминокислоты или ароматические аминокислоты. Кор-последовательность может быть увеличена в любом направлении с помощью аминокислот, которые в большинстве случаев являются липофильными, а именно алифатическими незаряженными аминокислотами, и ароматическими аминокислотами. Кроме того, как указано ранее, один или оба, а обычно один конец олигопептида может быть замещен липофильной группой, обычно алифатической или аралкильной, имеющей от 8 до 36, обычно от 8 до 24 атомов углерода и менее двух гетероатомов в алифатической цепи, причем гетероатомы обычно представляют собой, кислород, азот и серу. Цепь может быть насыщенной или ненасыщенной, желательно имеющей не более 3 сайтов, обычно не более 2 сайтов, алифатической ненасыщенности. Удобно, что можно использовать коммерчески доступные алифатические жирные кислоты, спирты и амины, такие, как лауриновая кислота, миристиловый спирт, стеариловый амин и т.п. Может быть проведена реакция липофильных групп с соответствующей функциональной группой олигопептида в соответствии с обычными способами, часто во время синтеза на носителе, в зависимости от сайта прикрепления олигопептида к носителю. Композиции, представляющие особый интерес, имеют следующую формулу:
Arg-U-X-X-Arg-X-X-X-J-Tyr,
в которой все символы были определены выше, за исключением U, и U представляет собой незаряженную алифатическую аминокислоту или ароматическую аминокислоту, в частности неполярную алифатическую аминокислоту или ароматическую аминокислоту. Последовательности по настоящему изобретению находят различное применение. В исследовательских целях их можно использовать для анализа физиологических путей, связанных с активацией и деактивацией ЦТЛ. Можно комбинировать ЦТЛ, в частности клеточные линии ЦТЛ, имеющие известные пептидные мишени, с пептидами по настоящему изобретению, в частности помеченными радиоактивной меткой, в присутствии или в отсутствие антигенпредставляющих клеток, по отношению к которым узко применимы эти ЦТЛ. После лизиса, осуществленного с помощью ЦТЛ, можно отделить активированные клетки ЦТЛ от покоящихся клеток ЦТЛ, с помощью маркера CD69, который отрегулирован in vitro на активацию. Разделение можно выполнить с помощью FACS (клеточного сортера с возбуждением флуоресценции) и анти-CD69, помеченного флуоресцентной меткой. Выделив наиболее флуоресцентные клетки, например, с наиболее высоким показателем в 25%, затем лизируют эти клетки и выделяют белки, связанные с используемыми маркерами, например, с помощью хроматографии, неденатурирующего электрофореза или тому подобного. В качестве альтернативы белки разделяют с помощью электрофореза, а затем используют вестерн-блоттинг или другие методики с мечеными пептидами, чтобы идентифицировать белки, с которыми связаны пептиды по настоящему изобретению. Вместо радиоактивной метки можно использовать любой другой тип метки, обычно небольшую молекулу органического вещества, такого, как биотин, флюоресцентное вещество и т.п. Если используют биотин, то после разделения можно добавить авидин, причем авидин помечен с помощью метки, описанной выше. Можно также сравнить Т-клетки, которые были объединены с антигенпредставляющими клетками в присутствии и в отсутствие пептидов по настоящему изобретению. В каждом случае можно получить библиотеки кДНК и использовать репрезентативный дифференциальный анализ, вычленение или тому подобные методы, чтобы обнаружить различия в экспрессии между клетками, которые были активированы в присутствии и в отсутствие пептидов по настоящему изобретению. Можно также определить, отличается ли реакция определенных субпопуляций ЦТЛ от реакции других субпопуляций на пептиды по настоящему изобретению, на основе их экспрессии или отсутствия экспрессии одного или более белков, в частности белков поверхности мембран. Таким образом можно идентифицировать ЦТЛ, которые можно удалить с помощью лейкофореза и подобных методов, чтобы свести к минимуму нежелательную атаку ткани клетками ЦТЛ. Сообщается, что пептиды







модулировать активность гемсодержащих ферментов как in vitro, так и in vivo. Как показано ниже, пептиды по настоящему изобретению имитируют порфириноподобные структуры, способные модулировать активность гемсодержащих ферментов, таких, как гемоксигеназа (ГО), различные изоформы синтазы окиси азота (NOS), циклооксигеназа, гуанилатциклаза и тому подобные. Поэтому композиции по настоящему изобретению могут использоваться в ситуациях, когда желательно отрегулировать экспрессию гемсодержащего фермента, например гемоксигеназы. В связи с этим известно, что гемоксигеназа участвует в путях метаболизма, иных, чем модуляция лимфоцитической активности. Поэтому при регулировке экспрессии гемоксигеназы будет оказано неблагоприятное воздействие на те пути метаболизма, в которых участвует гемоксигенеза. См., например, Willis et al., Nature Medicine, 2:87-89 (1996). Кроме того, сообщается, что гемсодержащие ферменты, такие, как гемоксигеназа, являются фактором воспалительной реакции и могут оказывать противовоспалительное действие. Поэтому пептиды по настоящему изобретению можно использовать в культурах для оценки роли гемсодержащих ферментов в различных физиологических процессах, путем сравнения клеточных реакций в присутствии и в отсутствие пептидов по настоящему изобретению. Пептиды по настоящему изобретению можно также использовать in vivo для уменьшения воспалительной реакции, связанной с септическим шоком, болезнью Крона, колитом, включая как неспецифический язвенный колит, так и слизистый колит, ревматоидным артритом, атеросклерозом, повторной перфузией, инфекцией и тому подобным. Описание использования пептидов по настоящему изобретению для модуляции лимфоцитической активности существенно применимо для этих показаний. Пептиды по настоящему изобретению также можно использовать для задержки наступления аутоиммунного заболевания у относящегося к млекопитающим субъекта, подверженного риску развития такого аутоиммунного заболевания. Пептиды по настоящему изобретению особенно применимы для задержки наступления инсулинзависимого сахарного диабета (ИЗСД), ревматоидного артрита или системной эритематозной волчанки у млекопитающих, подверженных риску развития этих заболеваний. Описание использования пептидов по настоящему изобретению для модуляции лимфоцитической активности существенно применимо для этих показаний. Нижеследующие примеры предлагаются только в качестве иллюстраций, а не в качестве ограничения настоящего изобретения. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Компьютерная программа, использованная для предсказания и разработки иммуносупрессивной активности пептидов и псевдопептидов, осуществлялась следующим образом. 1. МЕТОДИКА
На основе набора первоначальных экспериментальных данных, полученных для пептидов, проявляющих или не проявляющих иммуносупрессивную активность, было получено следующее. i. Консенсусная последовательность, содержащая аминокислоты, требующиеся для активности и позволяющие получать библиотеки новых пептидов или псевдопептидов. ii. Набор физико-химических и топологических свойств, связанных с активностью, и преобразованный в набор ограничений с помощью методики картирования переменных (Grassy et al. , J. of Molecular Graphics, 13:356-367 (1995)). 2. КАРТИРОВАНИЕ ПЕРЕМЕННЫХ
Способ основан на физико-химических и топологических ограничениях, полученных на основе результатов первоначального набора данных. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ ОГРАНИЧЕНИЯ
Способ требует определения физико-химических ограничений, определяемых как диапазоны свойств для указанной биологической активности. Способ расчета, использованный для определения набора ограничений, называется способом картирования переменных и описывается ниже. СПОСОБ КАРТИРОВАНИЯ ПЕРЕМЕННЫХ
Этот количественный метод состоит из оценки распределения (глобального или процентного) активных и неактивных молекул как функции значений данных параметров. Суперпозиция всех графов (активность-свойство) указывает, для определенных параметров, на лимитирующие значения (низкие и/или повышенные), которые необходимы для получения активного соединения. Этот графический способ выявляет качественные нелинейные зависимости между активностью и молекулярными свойствами. Что касается свойств, связанных с взаимодействиями лиганд рецептора, то было четко установлено, что существование строгой сопряженности признаков, определяющих приспосабливаемость к рецептору, подразумевает включение определенных структурных и физико-химических свойств. Этот способ дает простые правила, которые можно использовать для прогнозирования активности неизвестных продуктов. Графическое представление, показывающее количество случаев успешного выполнения правила по отношению к числу случаев нарушения правила, позволяет сравнить распределения с показателями активности для всего изучавшегося набора молекул. 3. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ И ТОПОЛОГИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ, ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОГРАНИЧЕНИЙ, СВЯЗАННЫХ С ИММУНОСУПРЕССИВНОЙ АКТИВНОСТЬЮ ПЕПТИДОВ И ПСЕВДОПЕПТИДОВ. ЛИПОФИЛЬНОСТЬ
Липофильность пептидов выражали в виде 1оgР (где Р представляет собой коэффициент распределения определенного пептида между водой и н-октанолом). Молекулярные значения logP можно рассчитать с помощью программы TSAR 2.31, используя атомные возрастающие значения logP, определенные Гоузом и др. (Ghose et al., J. Chem. Inf. Comput., 29:163 (1989). Как показано с помощью анализа первоначального набора данных, липофильность иммуносупрессивного пептида должна быть

ИНДЕКС БАЛАБАНА (Balaban, Chem. Phys., 89:399 (1982))
Индекс Балабана, рассчитываемый для соединенного молекулярного графа (Н подавленное), рассчитывают следующим образом:

где М представляет собой количество ребер в графе,


Молекулярный объем рассчитывают, принимая стандартное значение радиусов Ван дер Ваальса для каждого элемента. Этот расчет выполняется на расширенной конформации пептида. ЭЛЛИПСОИДНЫЙ ОБЪЕМ
Этот объем рассчитывают после определения трех компонентов момента инерции молекулы, принимая средние значения атомных масс для составляющих соединение атомов. Этот расчет выполняется на расширенной конформации пептида. МОЛЯРНАЯ ПРЕЛОМЛЯЮЩАЯ СПОСОБНОСТЬ
Молярную преломляющую способность рассчитывают с помощью значений атомной молярной преломляющей способности, рассчитанных Ghose et al. (цитированы выше). ДИПОЛЬНЫЙ МОМЕНТ
Этот параметр рассчитывают на расширенной конформации пептидов. Общий дипольный момент для молекулы выражается в единицах Debye.


где ri представляет собой расстояние от атома i до начала координат, a qi представляет собой заряд атома i. Заряды атомов рассчитывают с помощью способа Charge-2 (Abraham and Smith, J. Comput. Aided Mol. Design, 3:175-187 (1989)). ИНДЕКС КИРА Chi V 4
Этот индекс представляет собой один из индексов связности, разработанных Киром (L. B. Kier). Индекс Кира Chi V 4 рассчитывают в несколько этапов (Н включенное). А. Определение и нумерация всех путей длины 4 на молекулярном графе пептида. Б. Расчет каждого пути длины 4 из следующих значений:
Cvs = П[(

для j=1,4, где



ИНДЕКС КИРА КАППА АЛЬФА
Индекс Кира Каппа альфа 1 (K

Если А представляет собой общее количество атомов молекулы (Н включенное), то K


с:

ri представляет собой ковалентный радиус атома i, а rCsp 3 ковалентный радиус углерода sp3, P1 представляет собой общее количество путей длины = 1 вдоль молекулярного графа изучаемого пептида. Индекс Кира Каппа альфа 2 (K

Если А представляет собой общее количество атомов молекулы (Н включенное), то K


с

ri представляет собой ковалентный радиус атома i, а rCsp 3 ковалентный радиус углерода sp3, Р2 представляет собой общее количество путей длины = 2 вдоль молекулярного графа изучаемого пептида. ГИБКОСТЬ Phi
Основываясь на вышеприведенных формулах, гибкость молекулы можно определить следующим образом:
Phi = (K



где А представляет собой общее количество атомов (Н включенное). КОЛИЧЕСТВА АТОМОВ И ГРУПП
В качестве ограничений использовали также количество следующих типов атомов:
- общее количество атомов кислорода в пептиде,
- общее количество атомов азота в пептиде. В качестве ограничений использовали также количество следующих групп:
- общее количество этильных групп,
- общее количество гидроксильных групп. 4. ЗНАЧЕНИЯ ОГРАНИЧЕНИЙ
СОЗДАНИЕ БИБЛИОТЕК ПЕПТИДОВ ИЛИ ПСЕВДОПЕПТИДОВ
Начиная с консенсусной последовательности Аrg-Х-Х-Х-Аrg-Х-Х-Х-Х-Тyr, в которой Х представляет собой аминокислоту, которая определена в ранее приведенной аналогичной формуле, рассчитывали вышеописанные физико-химические и топологические параметры и определяли, находятся ли эти параметры в пределах ограничений, определенных первоначальным набором данных. Например, начиная с X= Leu, nLeu, Trp, Тyr, Gly и Val, создали библиотеку, состоящую из 279936 молекул, и только 26 из них удовлетворяли условиям требуемых ограничений. Диапазоны свойств, необходимых для получения биологической активности, суммированы в таблице 1. 8. ПОЛУЧЕНИЕ ХАРАКТЕРИСТИК КОНФОРМАЦИОННОГО ПРОСТРАНСТВА, ВОВЛЕЧЕННОГО В ИММУНОСУПРЕССИВНУЮ АКТИВНОСТЬ ПЕПТИДОВ И ПСЕВДОПЕПТИДОВ
ВЕКТОР ПРОСТРАНСТВЕННОЙ АВТОКОРРЕЛЯЦИИ СТРУКТУРЫ 3D
Концепция автокорреляционного описания молекулярной структуры была впервые введена Брото и др. (Broto et al. , Eur. J. Med. Chem., 19:66-70 (1984)). Этот вектор в основном представляет дискретизированное распределение расстояния, полученное из матрицы межатомных расстояний молекулы. Первый компонент этого вектора (А ) равен количеству атомов структур, а другие компоненты, А1. . .Аn, определяются количеством пар атомов, которые отделены расстоянием в пределах интервала, определяемого нижней границей (n-1)Di, где n представляет собой порядок элемента дискретизации вектора, а Di - приращение расстояния. Подобным же образом можно рассчитать распределение атомной характеристики Р. В этом случае взвешенный компонент автокорреляции АРn получают путем суммирования продуктов значений характеристики Р на атомах i, j, имеющих расстояния друг от друга, принадлежащие к интервалу расстояний [(n-1)Di, nDi]. Затем определяют количество компонентов вектора из уравнения nmax=(Dmax/Di)+1, в котором Dmax представляет собой наибольшее межатомное расстояние в структуре. Вектор автокорреляции проявляет несколько полезных свойств. - С помощью этого вектора можно существенно уменьшить объем данных конформации. Общая конформация описывается ограниченным набором n числовых значений. - Вектор очень легко рассчитать на основе данных координат 3D. Поэтому можно рассчитать и сохранять этот вектор в течение имитации молекулярной динамики, причем в этом процессе происходит уменьшение размера хранения по сравнению с классическим сохранением набора полных матриц расстояний, что позволяет осуществлять имитацию намного дольше, чем обычно. - Вектор автокорреляции конформации является переходно и ротационно инвариантным, а также независимым от количества атомов в молекуле. - Этот вектор чувствителен как к малым, так и к большим изменениям в конформации: чем больше изменяется конформация, тем больше модифицируются компоненты вектора. Чувствительность зависит от приращения расстояния, выбранного для расчетов, но приращение от


Применительно к пептиду HLA-B2702.75-84 (аминокислотная последовательность Arg-Glu-Asn-Leu-Arg-Ile-Ala-Leu-Arg-Tyr) и к его различным активным и неактивным производным пептидам выполнили имитации молекулярной динамики с помощью программы AMBER 4.1. Имитация одной наносекунды динамики создает набор в 103 конформаций (одна конформация в пикосекунду). Для каждой конформации рассчитали вектор автокорреляции 3D с помощью программы TSAR, с приращением расстояния в

КЛАСТЕРНЫЙ АНАЛИЗ
Для того, чтобы сравнить различные конформации, определили матрицу расстояний между всеми этими конформациями в гиперпространстве, определяемом компонентами их невзвешенных векторов автокорреляции 3D. Чем более аналогичны структуры двух соединений, тем короче расстояние между ними. Этот способ обеспечивает возможность количественного определения жесткого молекулярного соответствия. При использовании стартовой информации в качестве эталона числовое значение этого расстояния является аналогом среднеквадратического отклонения. АНАЛИЗ ГЛАВНЫХ КОМПОНЕНТОВ (РСА)
РСА представляет собой многомерный статистический метод анализа данных, пригодный для представления молекул в гиперпространстве их свойств (молекулярных дескрипторов). РСА можно использовать для того, чтобы свести большое число дескрипторов к меньшему числу синтетических ортогональных переменных, получаемых из линейной комбинации исходных дескрипторов. Этот способ сохраняет наибольшую часть первоначальной информации. Исходные переменные были нормализованы и была рассчитана диагонализация ковариантной матрицы с помощью классической трансформационной программы Якоби (Jacobi). Компоненты автокоррелограмного вектора 3К обеспечивают хорошее описание структуры 3К различных конформаций, но неудобны для работы, поскольку они содержат слишком много данных, что не позволяет обеспечить их легкую визуализацию. РСА может уменьшить размерность данных до представления в виде 2D или 3D, которое содержит максимально возможное количество исходной информации. При использовании РСА иммуносупрессивные пептиды проявляют хорошо определяемое общее конформационное пространство. Все пептиды, способные достигнуть этих конформационных показателей, могут проявлять иммуносупрессивную активность. КООРДИНАТЫ КОНФОРМАЦИОННОГО ПРОСТРАНСТВА БИОАКТИВНОЙ КОНФОРМАЦИЙ ПЕПТИДА bcl-nL
На фиг. 1 показано двумерное конформационное пространство и связанные с ним конформации пептида bcl-nL, в котором пептид bcl-nL имеет аминокислотную последовательность Arg-nL-nL-nL-Arg-nL-nL-nL-Gly-Tyr и в котором nL представляет собой норлейцин (см. ниже). Показанные структуры были получены посредством применения кластерного анализа на всей траектории пептида bcl-nL. ГЛАВНЫЕ КОНФОРМАЦИИ ПЕПТИДА bcl-nL
Структурные свойства главных исследованных конформаций пептида bcl-nL (фиг. 1, (1), (2), (3), (4) и (5)) и его конформационное пространство суммированы в таблице 2. Эти свойства касаются координат в трехмерном пространстве, определяемых тремя первыми главными компонентами (координатами РСА), а также радиуса кругового движения (Rg). КОНФОРМАЦИОННОЕ ПРОСТРАНСТВО АКТИВНЫХ ПЕПТИДОВ
Траекторию пептида D2 (аминокислотная последовательность Arg-Val-Asn-Leu-Arg-Ile-Ala-Leu-Arg-Tyr) описали с помощью метода автокорреляции 3D и данные проанализировали с помощью анализа главных компонентов. Это дало возможность получить главный план, определяемый 2 первыми главными компонентами, который содержит все конформации, исследованные в течение траектории. Траекторию пептида D2 использовали в качестве эталона траектории и все рассчитанные траектории спроектировали в этот главный план (фиг. 2). Иммуносупрессивные пептиды проявляют хорошо определяемое общее конформационное пространство, обладающее следующими характеристиками. Размеры РСА:
PC1: минимум = -2,0; максимум = 2,0
РС2: минимум = -2,0; максимум = 1,0
РС3: минимум = -1,0; максимум = 1,0
Пептиды, полученные в виде композиций, даны в таблице 3. ПРИМЕР 1. АНТИПРОЛИФЕРАТИВНАЯ АКТИВНОСТЬ bс-ПЕПТИДОВ
Взрослые 6-8-недельные самцы мышей линий C57BL6/J (В6, Н-2d), Ва1b/с(Н-2d) и CBA/JH-2k) были приобретены в Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME. Их сохраняли и поддерживали в лаборатории для содержания животных в SangStat Medical Corporation согласно указаниям Национального Института здоровья (США) и в соответствии с правилами Департамента здравоохранения. Пептиды синтезировали в synt:em (Nimes, Франция) с помощью синтезатора пептидов и методов Fmoc-химии. Все пептиды синтезировали в виде амидов, а затем преобразовывали в ацетатные соли. Пептиды очищали с помощью препаративной ВЭЖХ с обращенной фазой и с помощью аналитической ВЭЖХ с обращенной фазой показали, что они являются более чем на 95% гомогенными. Аминокислотное содержание подтверждали с помощью анализа аминокислот. Перед использованием пептиды сначала растворяли в 1 объеме ДМСО (Sigma), а затем добавляли 99 объемов культуральной среды. Окончательная концентрация ДМСО в культуре составляла не более 0,25%. Суспензии клеток селезенки получали после лизиса красных кровяных телец с помощью гипотонического шока. Затем клетки промывали в культуральной среде и, наконец, ресуспендировали в среде RPMI-1640 с 10% FBS (сыворотки плода коровы)(среда R-10) или в среде без сыворотки AIM-V (Gibco, Grand Island, NY). Клетки селезенки, выделенные из мышей линии СВА, затем подвергали стимуляции (по 2

Чтобы проанализировать влияние пептидов на цитотоксическую активность Т-клеток, получали эффекторные клетки СВА к В6, после 6 суток культивирования 4



где СРМ - количество отсчетов в минуту. Результаты, полученные из этих анализов, показали, что контрольный пептид 2705 при концентрациях вплоть до 100 мкг/мл не оказывал никакого влияния на опосредованный Т-клетками лизис клеток-мишеней, в то время, как bс-пептиды ингибировали опосредованный клетками лизис, причем степень ингибирования зависела от дозы. Полумаксимальное ингибирование активности клеток ЦТЛ, вызванное bс-петидами, наблюдалось при концентрации около 0,5 мкг/мл. ПРИМЕР 3. ВЛИЯНИЕ bс-ПЕПТИДОВ НА АЛЛОГЕННЫЕ ТРАНСПЛАНТАТЫ in vivo
Иммуносупрессивную активность bс-пептидов оценивали на модели васкуляризованного полностью несовместимого аллотрансплантата сердца мыши. Конкретно, абдоминальную гетеротопическую пересадку сердца осуществляли, как было ранее описано в работе Ono and Lindsey, J. Thoracic Cardiovasc. Surg., 7:225 (1969). Мышам линии СВА, являвшимся реципиентами сердец С57В1/6, ежедневно вводили различные дозы пептида, после пересадки органа. Пептиды растворяли в ДМСО и разбавляли в ЗФР (окончательная концентрация ДМСО составляла 10%) перед внутрибрюшинным введением. Животным вводили пептиды, начиная со дня трансплантации и до пятого или девятого дня. Приживание трансплантата отслеживали ежедневно путем прямой пальпации и отторжение определяли по прекращению пальпируемых сокращений сердца. Статистическую значимость продолжительности выживания сердечного аллотрансплантата рассчитывали с помощью теста Манна-Уитни. Результаты этих анализов показали, что контрольный пептид 2702.75-84 (аминокислотная последовательность Аrg-Glu-Asn-Leu-Arg-Lle-Ala-Leu-Arg-Tyr), введенный в дозе 80 мг/кг





Для того чтобы определить, способны ли bс-пептиды связываться с hsc70, выполняли анализы на связывание белков. Конкретно, синтезировали пептид 2702.75-84 в биотинилированной форме, с присоединенным к N-концу биотином, через состоящий из шести атомов углерода спейсер. На поверхность планшетов для ИФА (твердофазного иммуноферментного анализа) (Nunc Maxisorb, Nunc, США) наносили 100 нг/мл рекомбинантного hsc70 (Stressgen, Victoria, Canada) в 100 мМ Na-цитратного буфера с рН 4,0 и оставляли до следующего дня при температуре 4oС. После этого оставшиеся сайты связывания блокировали путем инкубации чашек с ЗФР/0,1% Твин 20 (PBS/Tween, Sigma) в течение 2 часов при комнатной температуре. Несвязанный материал удаляли путем троекратной промывки чашек смесью ЗФР/Твин. После добавки биотинилированного 2702.75-84 в смеси ЗФР/Твин/1%ДМСО чашки инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре, трижды промывали, затем инкубировали с 0,1 мкг/мл стрептавидина, конъюгированного с пероксидазой хрена (стрептавидин-HRP) (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) и снова промывали. Связанный стрептавидин-HRP обнаруживали с помощью 3 мг/мл о-фенилендиамина (OPD, Sigma) в субстратном буфере (SangStat, Menlo Park, CA). Реакцию останавливали добавлением 1М НСl и замеряли поглощение (оптическая плотность ОП490-ОП605), с помощью аппарата для прочтения планшетов ИФА. Связывание немеченого пептида замеряли в конкурентном анализе. Биотинилированный 2702.75-84 (3 мкМ) смешивали с различными количествами немеченого bс-пептида и затем инкубировали в планшетах с нанесенным на них hsc70 в течение 3 часов при комнатной температуре. Затем определяли связанный биотинилированный 2702.75-84, как описано выше. Результаты этих экспериментов показали, что аффинная хроматография с использованием пептида 2702.84-75-75-84 (инвертированного димера) привела к выделению hsc70 и hsp70 (хитшокового белка). После инкубации планшетов для ИФА, на поверхность которых был нанесен hsc70 с биотинилированным пептидом 2702.75-84, авторы настоящего изобретения наблюдали зависящее от дозы связывание этого пептида с hsc70. Связывание биотинилированного пептида 2702.75-84 с hsc70 может ингибироваться добавкой увеличивающихся концентраций пептида 2702.75-84. Полумаксимальное ингибирование (ИК50) наблюдалось при 7,0

Влияние bс-пептидов на hsc32 (гемоксигеназный) оценивали путем измерения активности гемоксигеназы (ГО) в присутствии и в отсутствие bс-пептидов. Конкретно, образцы мышиной селезенки гомогенизировали на льду в лизирующем буфере Трис-С1 (рН 7,4), содержащем 0,5% Тритона Х-100 и ингибиторы протеазы. Образцы замораживали небольшими аликвотами и так хранили до использования. Гомогенаты селезенки использовали в качестве источника ГО для всех измерений активности. Полученную из печени крыс биливердинредуктазу очищали способом, описанным в публикации Kutty and Maines, J. Biol. Chem., 256:3956 (1981). Активность ГО измеряли путем смешивания 100 мкл гомогената селезенки с 0,8 мкМ NADPH, 0,8 мМ глюкоза-6-фосфата, 1,0 единицы G-6-Р-дегидро-геназы, 1 мМ МgС12 и 10 мкл биливердинредуктазы при 4oС. Реакцию инициировали добавлением гемина (20 мкл 2,5 мМ раствора). Реакционную смесь инкубировали при 37oС в темноте в течение 30 минут. В конце инкубационного периода все нерастворимые материалы подвергали центрифугированию и анализировали надосадочную жидкость на концентрацию билирубина с помощью модифицированного метода Хилмана и Бейера (Hillman and Beyer, Z. Klin. Chem., 5:92 (1981) (с помощью диагностического набора 552 компании Sigma). Контрольные варианты включали образцы селезенки в отсутствие NADPH-генерирующей системы и все компоненты реакционной смеси в отсутствие гомогенатов селезенки. Результаты этих экспериментов показали, что по сравнению с неактивным контрольным пептидом 2705.75-84, bc-пептиды (100 мкг/мл) ингибировали активность ГО более, чем на 50%. Таким образом выяснилось, что, по-видимому, bс-пептиды способны ингибировать активность гемоксигеназы. После того, как было установлено, что bс-пептиды эффективно ингибируют активность гомоксигеназы, определяли действие bс-пептидов на другие гемсодержащие ферменты, такие, как синтаза окиси азота (NOS). Конкретно, bс-пептиды и контрольный пептид 2702 исследовали в анализах активности ферментов на их способность ингибировать три различных изоформы NOS (нейронную NOS, эндотелиальную NOS и индуцируемую цитокином NOS) in vitro. Результаты этих экспериментов показали, что bс-пептиды способны ингибировать NOS со значительно меньшим показателем ИК50, чем показатель контрольного пептида 2702. Таким образом выяснилось, что, повидимому, bс-пептиды имитируют порфириноподобные структуры, которые особенно влияют на активность гемсодержащих ферментов, и это было подтверждено с помощью компьютерного моделирования. ПРИМЕР 6. ОПОСРЕДОВАННОЕ bс-ПЕПТИДАМИ ИНГИБИРОВАНИЕ СИНТЕЗА ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЦИТОКИНОВ
Для того чтобы определить влияние bс-пептидов на синтез воспалительных цитокинов, на клетки макрофага RAW264.7 в культуре с 10 мкг/мл бактериального липополисахарида (ЛПС) воздействовали таким образом, чтобы стимулировать продуцирование ими воспалительного цитокина фактора-




Результаты, полученные в этих экспериментах, показали, что в то время как контрольный пептид D2RP (аминокислотная последовательность Arg-Val-Asn-Leu-Pro-Lle-Ala-Leu-Arg-Tyr) не проявил способности ингибировать продуцирование TNF-


Введение ЛПС мышам представляет собой приемлемую модель септического шока на животных (см. Otterbein et al., Amer. J. Physiol., 272 (2):1 (1997), Albrecht et al., Hepatology 26:1553-1559 (1997), Haziot et al., J. Immunol. 154: 6529-6532 (1995) и Otterbein et al., Amer. J. Respir. Cell Mol. Biol., 13: 595-601 (1995)). Для того чтобы получить еще больше доказательств полезности bс-пептидов для лечения воспалительных реакций и воспалительных состояний (таких, как септический шок), авторы испытывали влияние bс-пептидов на выживание мышей после введения им ЛПС. Конкретно, мышам вводили 20 мг/кг контрольного пептида 2705 или bс-пептида в маннитоле или только маннитол. Через 16 часов после введения пептида в маннитоле или только маннитола мышам вводили с помощью инъекции 100 мг/кг ЛПС и два раза в день отслеживали выживание мышей. Результаты этих экспериментов показали, что в то время как все мыши, которым вводили контрольный пептид 2705 в маннитоле или только маннитол, погибли на следующий день после введения ЛПС, более 50% мышей, получавших bс-пептид, были живы на второй день после введения ЛПС, и более 25% мышей, получавших bс-пептид, были живы на третий день после введения ЛПС. Таким образом, эти данные показывают, что bс-петиды эффективны для лечения воспалительных состояний, таких, как септический шок. ПРИМЕР 8. ВВЕДЕНИЕ bс-ПЕПТИДОВ ПОСРЕДСТВОМ ПЕРЕНОСА ГЕНОВ in vivo ПОВЫШАЕТ ВЫЖИВАЕМОСТЬ МЫШИНЫХ ГЕТЕРОТОПИЧЕСКИХ СЕРДЕЧНЫХ ТРАНСПЛАНТАТОВ
Далее авторы задались целью определить, может ли локальная доставка bс-пептидов путем опосредованного плазмидами переноса генов повысить выживаемость трансплантатов in vivo на мышиной модели гетеротопического сердечного трансплантата. Конкретно, неонатальные сердца донора C57BL/6 подкожно трансплантировали в наружное ухо мышей-реципиентов линии CBA/J. Во время трансплантации непосредственно в аллотрансплантат инъецировали bс-пептид или 20 мкг плазмидной ДНК, кодирующей представляющий интерес пептид. Выживание аллотрансплантатов определяли путем отслеживания электрокардиограмм и отторжение определяли на основе прекращения электрической активности сердца. Выживание трансплантатов выражали в сутках (среднее







Поскольку в настоящем описании показано, что пептиды по настоящему изобретению являются иммуномодулирующими, авторы изобретения далее поставили цель определить, являются ли bс-пептиды эффективными для подавления наступления аутоиммунных болезней in vivo. В качестве модели аутоиммунного заболевания вообще авторы определяли способность bс-пептидов задерживать или подавлять наступление ИЗСД in vivo. Конкретно, 20 мг/кг bс-пептида вводили внутрибрюшинно 6-недельным самкам мышей, не страдающих диабетом (НСД), в то время как контрольным мышам либо ничего не вводили, либо вводили неактивное пептидное соединение. Вышеуказанные варианты повторяли каждую неделю. У подопытных животных один раз в неделю определяли содержание глюкозы в крови. Наступление ИЗСД у подопытных животных определяли по уровню глюкозы в крови, превышающему 200 мг/дл. Результаты вышеописанных экспериментов показали, что у 70 - 80% контрольных НСД мышей, не получавших пептид, ИЗСД развился к возрасту 22 недель. Никакой разницы не наблюдалось между группами контрольных животных, которые либо не получали пептид, либо получали неактивный контрольный пептид. Однако для животных, которым вводили bс-пептиды, только у одного животного развился ИЗСД к возрасту 16 недель, а у всех остальных подопытных животных ИЗСД не развился к возрасту 24 недель. Таким образом, эти результаты показывают, что введение bс-пептидов эффективно для задержки наступления ИЗСД in vivo. Из вышеприведенных результатов очевидно, что композиции и методы по настоящему изобретению обеспечивают существенное ингибирование цитотоксичности ЦТЛ. При этом выяснилось, что пептиды по настоящему изобретению обеспечивают существенно повышенную эффективность ингибирования лизиса по сравнению с ранее применявшимися олигопептидами. Использование композиций по настоящему изобретению обеспечивает существенные преимущества, заключающиеся в том, что при этом требуются меньшие количества олигопептидов для достижения терапевтического уровня, а также в подавлении гемоксигеназной активности. Все публикации и заявки на патенты, упоминаемые в настоящем описании, включены в него в качестве ссылок в такой же самой степени, как если бы для каждой отдельной публикации или заявки на патент было бы конкретно и индивидуально указано, что они включены в качестве ссылки. Теперь, когда изобретение полностью описано, специалистам обычной квалификации в данной области техники очевидно, что можно осуществить много изменений и модификаций данного изобретения, которые не выходят за пределы существа или объема прилагаемой формулы изобретения.
Формула изобретения
B-X-X-X-B-X-X-X-J-Tyr,
в которой В - Lys или Arg;
X представляет собой любую аминокислоту, иную, чем заряженная алифатическая аминокислота, или ее D-изомер;
J - Gly, Lys или Arg, где указанные аминокислоты представляют собой существующие в природе L-изомеры, их D-изомеры и норлейцин и где указанный олигопептид включает иные, чем (а) встречающаяся в природе последовательность


(a) Arg-Leu-Leu-Leu-Arg-Leu-Leu-Leu-Gly-Tyr;
(b) Arg-Val-Leu-Leu-Arg-Leu-Leu-Leu-Gly-Tyr;
(c) Arg-Ile-Leu-Leu-Arg-Leu-Leu-Leu-Gly-Tyr;
(d) Arg-Leu-Val-Leu-Arg-Leu-Leu-Leu-Gly-Tyr;
(e) Arg-Leu-Ile-Leu-Arg-Leu-Leu-Leu-Gly-Tyr;
(f) Arg-Leu-Leu-Val-Arg-Leu-Leu-Leu-Gly-Tyr;
(g) Arg-Leu-Leu-Ile-Arg-Leu-Leu-Leu-Gly-Tyr;
(h) Arg-Leu-Leu-Leu-Arg-Val-Leu-Leu-Gly-Tyr;
(i) Arg-Leu-Leu-Leu-Arg-Ile-Leu-Leu-Gly-Tyr;
(j) Arg-Leu-Leu-Leu-Arg-Leu-Val-Leu-Gly-Tyr;
(k) Arg-Leu-Leu-Leu-Arg-Leu-Ile-Leu-Gly-Tyr;
(l) Arg-Leu-Leu-Leu-Arg-Leu-Leu-Val-GIy-Tyr;
(m) Arg-Leu-Leu-Leu-Arg-Leu-Leu-Ile-Gly-Tyr;
(n) Arg-Trp-Leu-Leu-Arg-Leu-Leu-Leu-Gly-Tyr;
(о) Arg-Leu-Trp-Leu-Arg-Leu-Leu-Leu-GIy-Tyr;
(p) Arg-Leu-Leu-Trp-Arg-Leu-Leu-Leu-Gly-Tyr;
(q) Arg-Leu-Leu-Leu-Arg-Trp-Leu-Leu-Gly-Tyr;
(r) Arg-Leu-Leu-Leu-Arg-Leu-Trp-Leu-Gly-Tyr;
(s) Arg-Leu-Leu-Leu-Arg-Leu-Leu-Trp-Gly-Tyr;
(t) Arg-Tyr-Leu-Leu-Arg-Leu-Leu-Leu-Gly-Tyr;
(u) Arg-Leu-Tyr-Leu-Arg-Leu-Leu-Leu-Gly-Tyr;
(v) Arg-Leu-Leu-Tyr-Arg-Leu-Leu-Leu-Gly-Tyr;
(w) Arg-Leu-Leu-Leu-Arg-Tyr-Leu-Leu-Gly-Tyr;
(x) Arg-Leu-Leu-Leu-Arg-Leu-Tyr-Leu-Gly-Tyr;
(y) Arg-Leu-Leu-Leu-Arg-Leu-Leu-Tyr-Gly-Tyr;
(z) Arg-Nle-Nle-Nle-Arg-Nle-Nle-Nle-Gly-Tyr. 7. Олигопептид по п.1, включающий олигопептид по п.6. 8. Олигопептид по п.7, который имеет не более 100 аминокислот. 9. Олигопептид по п.8, который имеет не более 30 аминокислот. 10. Олигопептид по п.9, который имеет не более 20 аминокислот. 11. Способ подавления активации лимфоцитных клеток, причем указанный способ включает соединение указанных клеток с подавляющим активацию количеством соединения, включающего олигопептид по любому из пп.1-6, причем активация указанных лимфоцитных клеток подавляется. 12. Способ по п.11, в котором указанная стадия соединения осуществляется в присутствии жизнеспособного твердого органа или жизнеспособных клеток, иных, чем лимфоцитные клетки. 13. Способ по п.11, в котором указанная стадия соединения включает осуществление контакта указанных лимфоцитных клеток с молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей указанный олигопептид, причем указанный олигопептид экспрессируется указанной молекулой нуклеиновой кислоты. 14. Способ по п. 13, в котором указанная молекула нуклеиновой кислоты содержится в вирусе. 15. Способ по п.11, в котором указанные лимфоцитные клетки представляют собой цитотоксичные Т-лимфоциты. 16. Способ трансплантации донорных органов или клеток млекопитающих, иных, чем часть жизнеспособного органа реципиента, представляющего собой млекопитающее, который включает взятие указанных донорного органа или клеток у донора и имплантацию указанному реципиенту, причем способ включает по меньшей мере следующие стадии: (а) соединение указанных органа или клеток перед имплантацией в указанном относящемся к млекопитающим реципиенте с подавляющим активацию количеством соединения, включающего олигопептид по любому из пп. 1-6 или (б) введение указанному относящемуся к млекопитающим реципиенту в течение периода времени, длящегося, начиная от момента перед имплантацией и до момента после имплантации указанных органа или клеток, подавляющего активацию количества соединения, включающего олигопептид по любому из пп.1-6. 17. Способ по п. 16, в котором указанная стадия соединения включает осуществление контакта указанных органа или клеток с молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей указанный олигопептид, причем указанный олигопептид экспрессируется указанной молекулой нуклеиновой кислоты. 18. Способ по п.16, в котором указанная стадия введения включает введение указанному относящемуся к млекопитающим реципиенту молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей указанный олигопептид, причем указанный олигопептид экспрессируется указанной молекулой нуклеиновой кислоты. 19. Способ по п.17 или 18, в котором указанная молекула нуклеиновой кислоты содержится в вирусе. 20. Способ ингибирования синтеза белка воспалительного цитокина клетками, способными продуцировать указанный белок воспалительного цитокина, причем указанный способ включает соединение указанных клеток с подавляющим синтез воспалительного цитокина количеством соединения, включающего олигопептид по любому из пп.1-6; причем синтез указанного воспалительного цитокина подавляется. 21. Способ по п.20, в котором указанная стадия соединения осуществляется в присутствии жизнеспособного твердого органа или жизнеспособных клеток, иных, чем те, которые способны продуцировать указанный белок воспалительного цитокина. 22. Способ по п.20, в котором указанный белок воспалительного цитокина выбирают из группы, состоящей из фактора-



23. Способ по п.20, в котором указанная стадия соединения включает осуществление контакта указанных клеток с молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей указанный олигопептид; причем указанный олигопептид экспрессируется указанной молекулой нуклеиновой кислоты. 24. Способ по п.20, в котором указанная молекула нуклеиновой кислоты содержится в вирусе. 25. Способ подавления воспалительной реакции у млекопитающих, причем указанный способ включает осуществление контакта указанного млекопитающего с подавляющим воспалительную реакцию количеством соединения, включающего олигопептид по любому из пп.1-6; причем указанная воспалительная реакция подавляется. 26. Способ по п.25, в котором указанная стадия осуществления контакта включает введение указанному млекопитающему молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей указанный олигопептид, причем указанный олигопептид экспрессируется указанной молекулой нуклеиновой кислоты. 27. Способ по п. 26, в котором указанная молекула нуклеиновой кислоты содержится в вирусе. 28. Способ по п.25, в котором указанная воспалительная реакция связана с септическим шоком, ревматоидным артритом, болезнью Крона или колитом. 29. Способ модуляции активности гемсодержащего фермента, причем указанный способ включает осуществление контакта системы, включающей указанный фермент, с модулирующим активность количеством соединения, включающего олигопептид по любому из пп.1-6; причем активность указанного гемсодержащего фермента модулируется. 30. Способ по п.29, в котором указанный гемсодержащий фермент выбирают из группы, состоящей из гемоксигеназы, синтазы окиси азота, циклооксигеназы и гуанилатциклазы. 31. Способ по п.29, в котором указанная стадия осуществления контакта включает введение в указанную систему молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей указанный олигопептид; причем указанный олигопептид экспрессируется указанной молекулой нуклеиновой кислоты. 32. Способ по п.31, в котором указанная молекула нуклеиновой кислоты содержится в вирусе. 33. Способ задержки наступления аутоиммунной болезни у млекопитающего, подверженного риску развития указанной болезни, причем указанный способ включает введение указанному млекопитающему подавляющего аутоиммунную болезнь количества соединения, включающего олигопептид по любому из пп.1-6; тем самым наступление аутоиммунной болезни подавляется. 34. Способ по п.33, в котором указанная аутоиммунная болезнь представляет собой инсулинзависимый сахарный диабет, ревматоидный артрит или системную эритроматозную волчанку. 35. Способ по п.33, в котором указанная стадия введения включает введение указанному млекопитающему молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей указанный олигопептид; причем указанный олигопептид экспрессируется указанной молекулой нуклеиновой кислоты. 36. Способ по п. 35, в котором указанная молекула нуклеиновой кислоты содержится в вирусе.
РИСУНКИ
Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5