Защищенные производные октреотида

 

Описаны производные октреотида общей формулы (1), где (D)A представляет собой остаток D-(N_indole-формил)триптофана; R¹ - атом водорода или трет-бутоксикарбонильная группа либо группа вида -СО-ОХ¹, где X¹ может принимать значения: 2-алкилсульфонилэтил, 2-фенилсульфонилэтил, 2-(4-замещенный арил)сульфонилэтил; R²= -CO-OX², где X² может принимать значения: 2-алкилсульфонилэтил, 2-фенилсульфонилэтил, 2-(4-замещенный арил)сульфонилэтил; R³ и R⁴ одновременно принимают значения -CH₂-NH-CO-Y, где Y - метил, алкил С₁-С₅, фенил, замещенный фенил, либо вместе составляют дисульфидную связь; R⁵ представляет собой атом водорода либо группу вида -СО-ОХ³, где X³ может принимать значения: 2-алкилсульфонилэтил, 2-фенилсульфонилэтил, 2-(4-замещенный арил)сульфонилэтил. Новые защищенные производные октреотида являются исходными соединениями для более эффективного и простого получения октреотида с улучшенным выходом. 2 табл.

Изобретение относится к новым исходным соединениям, применяемым для получения октреотида, а именно к защищенным пептидам общей формулы: где (D)A представляет собой остаток D-(N_indole-формил)триптофана; R¹ есть атом водорода или трет-бутоксикарбонильная группа, либо группа вида -СО-ОХ¹, где X¹ может принимать значения: 2-алкилсульфонилэтил, 2-фенилсульфонилэтил, 2-(4-замещенный арил)сульфонилэтил; R²=-CO-OX², где Х² может принимать значения: 2-алкилсульфонилэтил, 2-фенилсульфонилэтил, 2-(4-замещенный арил)сульфонилэтил; R³ и R⁴ одновременно принимают значения -CH₂-NH-CO-Y, где Y есть метил, алкил C₁-C₅, фенил, замещенный фенил, либо вместе составляют дисульфидную связь; R⁵ представляет собой атом водорода, либо группу вида -СО-ОХ³, где X³ может принимать значения: 2-алкилсульфонилэтил, 2-фенилсульфонилэтил, 2-(4-замещенный арил)сульфонилэтил.

Октреотид I является синтетическим аналогом соматостатина, который обладает сходным профилем фармакологической активности, но значительно превосходит природный пептид по силе и длительности действия. Подобно соматостатину он ингибирует секрецию пептидных гормонов гастропанкреатической эндокринной системы (инсулина, глюкагона, гастрина и пр.), а также гормона роста.

Октреотид применяется как лекарственное средство для лечения акромегалии, опухолей гастропанкреатической эндокринной системы, а также используется как действенное средство профилактики осложнений в панкреатической хирургии. Хелатные аналоги октреотида, меченные радиоактивными изотопами, например, индия, рения и технеция, применяются для локализации опухолей методами компьютерной сцинтиграфии.

Октреотид представляет собой циклический октапептид следующей структуры: Особенностями его структуры являются: - наличие двух D-аминокислот;
- наличие дисульфидного цикла;
- восстановленный С-концевой остаток треонина (треонинол);
- высокое содержание гидрофобных ароматических аминокислот.

Существенным с точки зрения химического синтеза является также наличие неустойчивого к действию окислителей и сильных кислот остатка триптофана. Синтез октреотида может быть осуществлен как твердофазньм методом, так и классическими методами пептидного синтеза в растворе.

Патент США 4395403 описывает способ синтеза октреотида в растворе. По этому способу из защищенных дипептидных сегментов синтезируется защищенный октреотид, содержащий остаток -трет-бутоксикарбонил-лизина и остатки цистеина, блокированные п-метоксибензильными группами, который затем подвергается полному деблокированию действием трифторацетата бора и тиоанизола в трифторуксусной кислоте и окислению кислородом воздуха в разбавленном водном растворе. Подобный способ деблокирования требует применения больших объемов органических растворителей (>1 л/г) для выделения деблокированного пептида; кроме того, существует риск частичной деструкции остатка триптофана при действии сильных кислот на стадии финального деблокирования.

Основные проблемы синтеза октреотида твердофазным методом связаны с наличием в его молекуле С-концевого остатка треонинола. Треонинол не содержит карбоксильной группы, что не дает возможности использовать традиционные методы присоединения первой (С-концевой) аминокислоты к полимерной матрице. В работе W. B. Edwards, et al. (J. Med. Chem. 1994, 37, 3749) синтез осуществляли, начиная с предпоследнего остатка Cys(Acm), присоединенного к полимеру сложноэфирной связью. После сборки пептид окисляли до дисульфида на полимере, затем получали защищенный [D-Trp(Boc)⁴, Lys(Boc)⁵, Тhr(Вu^t)⁶]-октреотид путем аминолиза пептидил-полимера избытком треонинола. Аминолиз протекал очень медленно, и общий выход защищенного пептида составил 14%.

Более эффективньм оказался способ Y. Arano, et al. (Bioconjugate Chem. 1997, 8, 442), которые синтезировали октреотид, начиная с остатка Fmoc-Thr(Bu^t)-ol, присоединенного к 2-хлор-тритильному полимеру. Однако синтез необходимого для этой цели защищенного производного треонинола представляет отдельную непростую задачу.

В патенте США 5889146 описан синтез октреотида, в котором С-концевой остаток треонинола присоединяли к полимеру путем образования циклического ацеталя с полимер-связанным терефталевым альдегидом. Такой циклический ацеталь обеспечивает одновременную защиту обеих гидроксильных групп треонинола и легко расщепляется кислотными реагентами в условиях удаления защитных групп трет-бутильного типа.

Следует отметить, что известные твердофазные способы получения октреотида разработаны в основном с целью последующего синтеза конъюгатов с хелатами, биотином и другими маркерньми молекулами, реализованы в микромасштабе (0,1-0,25 ммоль) и практически не пригодны для синтеза октреотида в граммовых и более количествах, так как предполагают использование малодоступных и дорогостоящих исходных материалов - защищенных аминокислот, специальных полимеров и конденсирующих реагентов для твердофазного синтеза.

Таким образом, существует необходимость в эффективных и масштабируемых способах получения октреотида.

Целью предлагаемого изобретения является изыскание новых защищенных пептидов, которые можно было бы использовать в качестве исходных соединений для эффективного и масштабируемого синтеза октреотида.

Поставленная цель достигается тем, что предлагаются новые соединения, а именно защищенные пептиды общей формулы:

где (D)A представляет собой остаток D-(N_indole-формил)триптофана;
R¹ есть атом водорода, или трет-бутоксикарбонильная группа, либо группа вида -СО-ОХ¹, где X¹ может принимать значения: 2-алкилсульфонилэтил, 2-фенилсульфонилэтил, 2-(4-замещенный арил)сульфонилэтил;
R²=-СО-ОХ², где Х² может принимать значения: 2-алкилсульфонилэтил, 2-фенилсульфонилэтил, 2-(4-замещенный арил)сульфонилэтил;
R³ и R⁴ одновременно принимают значения -CH₂-NH-CO-Y, где Y есть метил, алкил C₁-C₅, фенил, замещенный фенил, либо вместе составляют дисульфидную связь;
R⁵ представляет собой атом водорода, либо группу вида -СО-ОХ³, где X³ может принимать значения: 2-алкилсульфонилэтил, 2-фенилсульфонилэтил, 2-(4-замещенный арил)сульфонилэтил.

Предметом предлагаемого изобретения таким образом являются производные октреотида II и III, содержащие N_indole-формилированный остаток D-триптофана, защищенную -аминогруппу в остатке лизина, S-защищенные (II) или окисленные до циклического дисульфида (III) остатки цистеина
H-D-Phe-Cys(R³)-Phe-D-Trp(For)-Lys(R²)-Thr-Cys(R⁴)-Thr-ol (II)

где R², R³, R⁴ принимают указанные выше значения.

Предметом изобретения являются также производные IV-IX, которые могут содержать дополнительно защитные группы R¹ на -аминогруппе N-концевого остатка D-фенилаланина и/или R⁵ на гидроксильных группах С-концевого остатка треонинола:
R¹-D-Phe-Cys(R³)-Phe-D-Trp(For)-Lys(R²)-Thr-Cys(R⁴)-Thr-ol; (IV)

H-D-Phe-Cys(R³)-Phe-D-Trp(For)-Lys(R²)-Thr-Cys(R⁴)-Thr-ol(R⁵)₂; (VI)

R¹-D-Phe-Cys(R³)-Phe-D-Trp(For)-Lys(R²)-Thr-Cys(R⁴)-Thr-ol(R⁵)₂; (VIII)

где R¹Н, а группы R²-R⁵ принимают указанные выше значения.

Защитные группы R¹ (для случая, если R¹=-CO-OX¹), R², R⁵ представляют собой удаляемые основаниями группировки 2-алкил- или 2-арилсульфонилэтильного типа: карбаматные (уретановые) для N-концевой -аминогруппы и остатка Lys (R¹= -CO-OX¹, R²=-CO-OX²) и карбонатные для гидроксильных групп остатка треонинола (R⁵= -СО-ОХ³). Очевидно, что 2-алкил(арил)сульфонилэтильные заместители ¹-Х³ могут использоваться в различных сочетаниях, быть одинаковыми или разными, однако на практике предпочтительно использовать однородные защитные группы (X¹= X²= Х³), например, из числа описанных в литературе (Таблица 1).

Защитные группы R³ и R⁴ для остатков цистеина выбираются из числа ациламидометильных (S,N-ацетальных) групп, способных к отщеплению при действии окислительных реагентов, например иода, сульфенилгалогенидов, трифторацетата таллия (III), с одновременным образованием дисульфида. Такие защитные группы, например ацетамидометильная (Асm), бензамидометильная (Bzm), трет-бутилацетамидометильная (Tacm), a также способы их введения и удаления описаны в литературе. Группы R³ и R⁴ могут быть разными, однако предпочтительно использовать одинаковые защитные группы (R³=R⁴).

Защищенные пептиды II-IX являются новыми, не описанными ранее веществами.

Для синтеза пептидов II-IX могут быть использованы приемы и методы пептидного синтеза, описанные в литературе.

Пептид IV можно синтезировать, например, методом ступенчатого наращивания пептидной цепи от С-конца к N-концу с использованием N-защищенных аминокислот; стартовым С-концевым остатком в данном случае может быть треонинол с незащищенными гидроксильньми группами. В качестве временной N-защиты можно применять группу, удаляемую мягким ацидолизом, например трет-бутоксикарбонильную, трет-амилоксикарбонильную, 4-метоксибензилоксикарбонильную или иные известные защитные группы. Для активации карбоксильных групп аминокислотных остатков, вводимых в пептидную цепь можно использовать разнообразные методы, описанные в литературе, например, метод активированных эфиров, метод смешанных ангидридов, карбодиимидный метод. Для защиты -аминогруппы N-концевого остатка D-Phe применяется группа R¹Н. Альтернативно аминокислотная последовательность октапептида может быть разбита на сегменты различной длины, каждый из которых синтезируется отдельно, после чего из этих сегментов собирается полная пептидная цепь. Деблокирование и окисление остатков цистеина в пептиде IV, например, действием иода или иных реагентов, упомянутых выше, приводит к пептиду V.

Если в пептидах IV и V группа R¹ представляет собой уретановую группу, удаляемую ацидолизом, например трет-бутоксикарбонильную, то ее удаление действием кислоты дает пептиды II и III соответственно. Альтернативно пептид III может быть получен путем деблокирования и окисления остатков цистеина в пептиде II, как указано выше.

При использовании в качестве стартового С-концевого остатка треонинола, содержащего гидроксильные группы, блокированные карбонатными защитными группами R⁵, с помощью способов, аналогичных описанным выше для пептидов II-V, могут быть получены пептиды VI, VII, VIII, IX.

Защищенные пептиды III, V, VII, IX (при R¹=-СО-ОХ¹) можно непосредственно использовать для получения октреотида. Для это цели в указанных пептидах необходимо удалить имеющиеся защитные группы R¹, R², R⁵, а также N_indoie-формильную группу с остатка D-триптофана.

Для удаления защитных групп пептиды III, V, VII, IX подвергают кратковременному действию разбавленного раствора основания, например обработке 0,1 н. водным раствором гидроксида натрия в течение 3-20 мин при температуре от 0 до 20^oС, смесь нейтрализуют, например, добавлением избытка уксусной кислоты, после чего выделяют из полученного раствора октреотид известными способами, например, ионообменной или/и обращеннофазовой хроматографией.

Сущность предлагаемого изобретения иллюстрируется примерами. При описании примеров используются следующие сокращения и условные обозначения:
ДМФА - диметилформамид
ДЦГК - дициклогексилкарбодиимид
ОБТ- 1-гидроксибензотриазол
ТФУ - трифторуксусная кислота
ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография
Аст - ацетамидометил
Bzm - бензамидометил
Вос - трет-бутоксикарбонил
Thr-ol - остаток L-треонинола [(2S,3R)-1,3-дигидрокси-2-аминобутана]
Сокращенные обозначения аминокислот и защитных групп используются в соответствии с рекомендациями Комиссии по биохимической номенклатуре при IUPAC-IUB, опубликованными в Eur. J. Biochem., 1984, v. 138, No. 1, pp. 9-37. Сокращенные обозначения 2-алкил(арил)сульфонилэтильных защитных групп приведены в таблице 1. Оптически активные аминокислоты и их производные, приведенные в описаниях примеров, по умолчанию имеют L-конфигурацию.

Значения хроматографических подвижностей R_f приведены для пластинок для тонкослойной хроматографии Alufоlien Kieselgel 60 F₂₅₄ (Merck, ФРГ) в системах хлороформ-метанол-уксусная кислота, 95:5:3 (А) или 90:10:3 (Б); этилацетат-пиридин-уксусная кислота-вода, 60:5:15:10 (В). Обнаружение пятен на пластинках проводили в УФ-свете и нингидриновым реактивом после прогревания. Массы молекулярных ионов (М+H)⁺ измерены на времяпролетном масс-спектрометре МСБХ-1 (НПО "Электрон", Украина) или на масс-спектрометре MALDI-TOF VISION 2000 (Thermo Bioanalysis, Англия). Анализ аминокислотного состава проводили на анализаторе Biotronik LC5001 после кислотного гидролиза образцов пептидного материала в запаянных ампулах (3 М метансульфокислота, 1% фенол, 24ч, 110^oС).

Пример 1. Boc-D-Phe-Cys(Bzm)-Phe-D-Trp(For)-Lys(Psc)-Thr-Cys(Bzm)-Thr-ol (пептид IVa).

a. Boc-Cys(Bzm)-Thr-ol. К раствору 4,4 г трифторацетата треонинола и 10,5 г пентафторфенилового эфира Boc-Cys(Bzm) в 100 мл ДМФА добавляют 3,75 мл N, N-диизопропилэтиламина и перемешивают смесь 4 ч при комнатной температуре. Смесь упаривают в вакууме до масла, остаток растворяют в 200 мл этилацетата, промывают 280 мл полунасыщенного водного раствора NaCl и упаривают досуха. Остаток обрабатывают эфиром и получают 7,2 г целевого соединения; R_f 0,40 (Б); m/z=443,2, M+H⁺ (вычислено 442,6).

б. Boc-Thr-Cys(Bzm)-Thr-ol. 7,0 г Boc-Cys(Bzm)-Thr-ol растворяют в 50 мл охлажденной в ледяной бане ТФУК, через 20 мин при 0^oС упаривают до масла, переупаривают с 250 мл толуола. Полученный трифторацетат H-Cys(Bzm)-Thr-ol растворяют в 100 мл ДМФА, добавляют 4 мл N,N-диизопропилэтиламина, затем при перемешивании 6,6 г пентафторфенилового эфира Вос-треонина. Смесь перемешивают 2 ч при комнатной температуре и упаривают в вакууме до масла. Остаток растворяют в 200 мл этилацетата, промывают 280 мл полунасыщенного водного раствора NaCl и упаривают досуха. После обработки эфиром получают 7,9 г целевого соединения; R_f 0,35 (Б); m/z=542,6, М+Н⁺ (вычислено 543,7).

в. Boc-Lys(Psc)-Thr-Cys(Bzm)-Thr-ol. С 7,5 г Boc-Thr-Cys(Bzm)-Thr-ol удаляют Вос-защиту, как описано в примере 1б, полученный трифторацетат растворяют в 100 мл ДМФА, добавляют 4 мл N,N-диизопропилэтиламина и 0,9 г ОБТ, затем при перемешивании 9,6 г 2,4,5-трихлорфенилового эфира Boc-Lys(Psc). Смесь перемешивают 5 ч при комнатной температуре и упаривают в вакууме до масла. Остаток обрабатывают эфиром, осадок отфильтровывают, промывают эфиром и получают 10,6 г целевого соединения; R_f 0,45 (Б); m/z=883,6, М+Н⁺ (вычислено 884,1).

г. Boc-D-Trp(For)-Lys(Psc)-Thr-Cys(Bzm)-Thr-ol. С 10,5 г Boc-Lys(Psc)-Thr-Cys(Bzm)-Thr-ol удаляют Вос-защиту, как описано в примере 1б, полученный трифторацетат растворяют в 100 мл ДМФА, добавляют 4 мл N,N-диизопропилэтиламина и 1,0 г ОБТ, затем при перемешивании 6,5 г 2,4,5-трихлорфенилового эфира Boc-D-Trp(For). Смесь перемешивают 10 ч при комнатной температуре и упаривают в вакууме до масла. К остатку добавляют этилацетат, выпавший осадок отфильтровывают, промывают эфиром и получают 11,9 г целевого пентапептида; R_f 0,45-50 (Б); m/z=1082,6, М+H⁺ (вычислено 1083,3).

д. Boc-D-Phe-Cys(Bzm)-Phe-OH. К раствору 3,3 г фенилаланина и 3,5 мл триэтиламина в 20 мл воды и 50 мл ДМФА при интенсивном перемешивании добавляют порциями раствор 7,9 г пентафторфенилового эфира Boc-Cys(Bzm) в 30 мл ДМФА и перемешивают смесь 4 ч при комнатной температуре. Смесь упаривают в вакууме до масла, к остатку добавляют 200 мл этилацетата и 100 мл 1 М водного KHSO₄. Органический слой промывают 280 мл насыщенного водного раствора NaCl и упаривают досуха. Остаток обрабатывают петролейным эфиром и получают Boc-Cys(Bzm)-Phe-OH, R_f 0,35 (А). Полученный дипептид растворяют в 50 мл ТФУК, через 10 мин раствор упаривают в вакууме и остаток обрабатывают эфиром. Осадок отделяют, растворяют в 30 мл воды и 50 мл ДМФА, добавляют при перемешивании 2,5 мл триэтиламина и 4,9 г п-нитрофенилового эфира Boc-D-Phe. Смесь перемешивают 18 ч при комнатной температуре, затем упаривают в вакууме до масла, к остатку добавляют 200 мл этилацетата и 100 мл 1 М водного KHSO₄. Органический слой промывают водой, насыщенным водным раствором NaCl и упаривают досуха. Остаток обрабатывают эфиром, выпавший осадок промывают эфиром и получают 7,0 г Boc-D-Phe-Cys(Bzm)-Phe-OH; R_f 0,55 (Б); m/z=648,9, М+Н⁺ (вычислено 649,8).

е. Boc-D-Phe-Cys(Bzm)-Phe-D-Trp(For)-Lys(Psc)-Thr-Cys(Bzm)-Thr-ol (пептид IIа). 2,17 г пентапептида Boc-D-Trp(For)-Lys(Psc)-Thr-Cys(Bzm)-Thr-ol (пример 1г) растворяют в 15 мл холодной ТФУК, через 20 мин раствор упаривают в вакууме и остаток обрабатывают эфиром. Осадок отделяют, растворяют в 20 мл ДМФА, добавляют 0,4 мл N,N-диизопропилэтиламина, 0,4 г ОБТ, 1,47 г Boc-D-Phe-Cys(Bzm)-Phe-OH (пример 1д), затем при охлаждении и перемешивании 0,51 г ДЦГК. Смесь перемешивают 3 ч при 0^oС и 18 ч при комнатной температуре, фильтруют, фильтрат упаривают в вакууме до масла. Остаток обрабатывают 100 мл этилацетата, выпавший осадок промывают этилацетатом, эфиром и получают 3,0 г пептида IVa; R_f 0,25-30 (Б), 0,65 (В); m/z=1615,1, М+Н⁺ (вычислено 1614,0).

Пример 2. Boc-D-Phe-Cys(Acm)-Phe-D-Trp(For)-Lys(Nsc)-Thr-Cys(Acm)-Thr-ol (пептид IVб).

Пептид IVб получают аналогично описанному в Примере 1; R_f 0,15-20 (Б), 0,55 (В); m/z=1535,4, М+Н⁺ (вычислено 1534,9).

Пример 3. Nsc-D-Phe-Cys(Bzm)-Phe-D-Trp(For)-Lys(Msc)-Thr-Cys(Bzm)-Thr-ol (пептид IVв).

Пептид IVв получают аналогично описанному в Примере 1; R_f 0,10-20 (Б), 0,60 (В); m/z=1561,4, М+Н⁺ (вычислено 1561,8).

Пример 4.

К раствору 1,62 г пептида IVa (Пример 1) в 700 мл уксусной кислоты и 200 мл воды при перемешивании приливают раствор 1,5 г иода в 80 мл уксусной кислоты и 20 мл воды и оставляют смесь на 2 ч при комнатной температуре. К смеси добавляют 2 г цинка порошка и перемешивают до обесцвечивания. Цинковый шлам отфильтровывают, фильтрат упаривают при пониженном давлении до объема 15-20 мл, к остатку добавляют 100 мл воды. Выпавший осадок отделяют, промывают водой и сушат на воздухе. Выход пептида Va 1,20 г; R_f 0,40 (В); m/z= 1345,4, М+H⁺ (вычислено 1345,7).

Пример 5. H-D-Phe-Cys(Bzm)-Phe-D-Trp(For)-Lys(Psc)-Thr-Cys(Bzm)-Thr-ol (пептид IIа).

0,81 г пептида IVa (Пример 1) растворяют в 10 мл охлажденной до 0^oС ТФУК, через 20 мин раствор упаривают и остаток обрабатывают эфиром. Получают 0,80 г трифторацетата пептида IIа. R_f 0,35 (В); m/z=1513,4, М+H⁺ (вычислено 1513,9).

Пример 6.

Трифторацетат пептида IIIa получают из пептида Va аналогично описанному в Примере 5; R_f 0,25 (В); m/z=1245,6, М+Н⁺ (вычислено 1245,3).

Пример 7.

К раствору 1,54 г пептида IVб (Пример 2) в 600 мл уксусной кислоты и 300 мл воды при перемешивании приливают раствор 1,5 г иода в 80 мл уксусной кислоты и 20 мл воды и оставляют смесь на 10 ч при комнатной температуре. К смеси добавляют раствор 2,5 г аскорбиновой кислоты в 50 мл воды и перемешивают до обесцвечивания, затем упаривают при пониженном давлении до объема 25-30 мл, к остатку добавляют 150 мл воды. Выпавший осадок отделяют, промывают водой и сушат на воздухе. Выход пептида Va 1,15 г; R_f 0,35 (В); m/z= 1391,4, M+H⁺ (вычислено 1390,7).

Пример 8.

Трифторацетат пептида IIIб получают из пептида Vб аналогично описанному в Примере 5; R_f 0,20 (В); m/z=1290,3, M+N⁺ (вычислено 1290,6).

Пример 9.

Пептид Vв получают из пептида IVв как описано в примере 7. _f 0,30 (В); m/z=1292,9, М+Н⁺ (вычислено 1293,5).

Пример 10. Boc-D-Phe-Cys(Bzm)-Phe-D-Trp(For)-Lys(Psc)-Thr-Cys(Bzm)-Thr-ol(Psc)₂ (пептид VIIIa).

a. Boc-Thr-ol(Psc)₂. К раствору 2,1 г Вос-треонинола в 20 мл дихлорметана и 3 мл пиридина при охлаждении в ледяной бане и перемешивании добавляют 5,9 г 2-фенилсульфонилэтилового эфира хлоругольной кислоты (Psc-Cl), смесь перемешивают 2 ч при 0^oС и 15 ч при комнатной температуре. К смеси добавляют 120 мл этилацетата и 100 мл 2 М KHSO₄, органический слой отделяют, промывают 2100 мл 2 М KHSO₄, 50 мл насыщенного водного раствора NaCl и упаривают досуха. Остаток хроматографируют на колонке с Kieselgel 60 (Merck, Германия), используя в качестве элюента этилацетат, и получают 4,4 г целевого дикарбоната в виде масла; R_f 0,70 (А).

б. Boc-Cys(Bzm)-Thr-ol(Psc)₂. С 4,4 г Boc-Thr-ol(Psc)₂ удаляют Вос-защиту, как описано в примере 1б, и полученный трифторацетат растворяют в 20 мл ДМФА. К раствору добавляют 2,65 г Boc-Cys(Bzm)-OH, 1,75 мл N,N-диизопропилэтиламина, 0,95 г ОБТ, затем при охлаждении до 0^oС 1,65 г ДЦГК. Смесь перемешивают смесь 1 ч при 0^oС и 6 ч при комнатной температуре, затем фильтруют и фильтрат упаривают в вакууме до масла. Остаток растворяют в 100 мл этилацетата, промывают водой, насыщенным водным раствором NаНСО₃, 2 М раствором KHSO₄, насыщенным водным раствором NaCl и упаривают досуха. Остаток обрабатывают петролейным эфиром и получают 5,6 г целевого соединения; R_f 0,65 (A); m/z=865,7, М+Н⁺ (вычислено 865,0).

в. Boc-Thr-Cys(Bzm)-Thr-ol(Psc)₂. С 5,6 г Boc-Cys(Bzm)-Thr-ol(Psc)₂ удаляют Вос-защиту, как описано в примере 1б, и полученный трифторацетат растворяют в 25 мл ДМФА. К раствору добавляют 1,55 г Boc-Thr-OH, 1,5 мл N, N-диизопропилэтиламина, 0,80 г ОБТ, затем при охлаждении до 0^oС, 1,55 г ДЦГК. Смесь перемешивают 1 ч при 0^oС и 5 ч при комнатной температуре, затем фильтруют и фильтрат упаривают в вакууме до масла. Остаток растворяют в 100 мл этилацетата, промывают водой, насыщенным водным раствором NaHCO₃, 2 М раствором KHSO₄, насыщенным водным раствором NaCl и упаривают досуха. Остаток обрабатывают эфиром и получают 5,3 г целевого трипептида; R_f 0,45 (А); после удаления Вос-группы m/z=866,4, М+Н⁺ (вычислено 865,9).

г. Boc-Lys(Psc)-Thr-Cys(Bzm)-Thr-ol(Psc)₂. С 5,3 г Boc-Thr-Cys(Bzm)-Thr-ol(Psc)₂ удаляют Вос-защиту, как описано в примере 1б, обрабатывают эфиром, полученный осадок трифторацетата растворяют в 25 мл ДМФА, добавляют 1,3 мл N,N-диизопропилэтиламина и 0,75 г ОБТ, затем при перемешивании 3,9 г 2,4,5-трихлорфенилового эфира Boc-Lys(Psc).Смесь перемешивают 5 ч при комнатной температуре и упаривают в вакууме до масла. Остаток обрабатывают эфиром, осадок отфильтровывают, промывают эфиром и получают 6,53 г тетрапептида; R_f 0,35-0,40 (А), 0,60 (Б); после удаления Вос-группы m/z=1206,6, M+H⁺ (вычислено 1206,4).

д. Boc-D-Trp(For)-Lys(Psc)-Thr-Cys(Bzm)-Thr-ol(Psc)₂. С 6,50 г Boc-Lys(Psc)-Thr-Cys(Bzm)-Thr-ol(Psc)₂ удаляют Вос-защиту, как описано в примере 1б, обрабатывают эфиром, полученный осадок трифторацетата растворяют в 30 мл ДМФА, добавляют 1,3 мл N, N-диизопропилэтиламина и 0,70 г ОБТ, затем при перемешивании 2,7 г 2,4,5-трихлорфенилового эфира Boc-D-Trp(For). Смесь перемешивают 12 ч при комнатной температуре и упаривают в вакууме до масла. К остатку добавляют эфир, выпавший осадок отфильтровывают, промывают эфиром и получают 7,6 г целевого пентапептида; R_f 0,45-55 (Б); после удаления Вос-группы m/z=1407,6, М+Н⁺ (вычислено 1407,8).

е. Boc-D-Phe-Cys(Bzm)-Phe-D-Trp(For)-Lys(Psc)-Thr-Cys(Bzm)-Thr-ol(Psc)₂ (пептид VIIIa). 3,1 г пентапептида Boc-D-Trp(For)-Lys(Psc)-Thr-Cys(Bzm)-Thr-ol(Psc)₂ растворяют в 15 мл холодной ТФУК, через 20 мин раствор упаривают в вакууме и остаток обрабатывают эфиром. Осадок отделяют, растворяют в 20 мл ДМФА, добавляют 0,4 мл N,N-диизопропилэтиламина, 0,4 г ОБТ, 1,47 г Boc-D-Phe-Cys(Bzm)-Phe-OH (пример 1д), затем при охлаждении и перемешивании 0,51 г ДЦГК. Смесь перемешивают 3 ч при 0^oС и 24 ч при комнатной температуре, фильтруют, фильтрат упаривают в вакууме до масла. Остаток обрабатывают 100 мл этилацетата, выпавший осадок промывают этилацетатом, эфиром и получают 3,9 г пептида VIIIa; R_f 0,35-45 (Б), 0,75 (В); после удаления Вос-группы m/z=1940,0, М+H⁺ (вычислено 1938,5).

Пример 11. Psc-D-Phe-Cys(Bzm)-Phe-D-Trp(For)-Lys(Psc)-Thr-Cys(Bzm)-Thr-ol(Psc)₂ (пептид VIIIб).

Пептид VIIIб получают аналогично описанному в Примере 10; R_f 0,35-40 (Б), 0,75 (В); m/z=2167,9, M+H⁺ (вычислено 2168,7).

Пример 12.

Пептид IXa получают из пептида VIIIa как описано в примере 4. R_f 0,55 (В); m/z =1768,6, М+H⁺ (вычислено 1768,1).

Пример 13.

Пептид IХб получают из пептида VIIIб как описано в примере 4. R_f 0,55 (В); m/z=1900,0, М+Н⁺ (вычислено 1898,2).

Пример 14. H-D-Phe-Cys(Bzm)-Phe-D-Trp(For)-Lys(Psc)-Thr-Cys(Bzm)-Thr-ol(Psc)₂ (пептид VIa).

Трифторацетат пептида VIa получают из пептида VIIIa аналогично описанному в Примере 5; R_f 0,35 (В); m/z=1940,3, М+Н⁺ (вычислено 1938,5).

Пример 15

Трифторацетат пептида VIIa получают из пептида IХа аналогично описанному в Примере 5; R_f 0,25 (В); m/z=1668,3, M+H⁺ (вычислено 1668,0).

Пример 16. Получение октреотида (I).

145 мг (100 мкмоль) трифторацетата пептида IIIб растворяют в 10 мл смеси ДМФА-вода (1: 2). К раствору при сильном перемешивании в течение 30 с добавляют по каплям 1,5 мл 1 н. водного раствора гидроксида натрия и перемешивают еще 5 мин, затем добавляют 0,5 мл уксусной кислоты. Смесь разбавляют водой до 50 мл и наносят на колонку 25100 мм с целлюлозой СМ-52 (Whatman, Англия), уравновешенную 0,03 М ацетатом аммония (рН 5,9). Проводят элюцию градиентом от 0,05 до 0,5 М ацетата аммония (рН 5,9), фракции, содержащие целевой продукт, объединяют и лиофилизуют. Получают 59 мг октреотида ацетата; хроматографическая чистота по ВЭЖХ 94%, массовое содержание пептидного материала (на октреотид диацетат) 82% (выход 42 мкмоль). Масс-спектр: (М+Н)⁺ 1019,8 (вычислено: 1020,31); аминокислотный состав: Thr 0,94 (1); Phe 2,04 (2); Trp 0,92 (1); Lys 1,00 (1); Cys - не определяется.

Аналогично получают октреотид деблокированием других описанных выше защищенных пептидов (таблица 2).

Формула изобретения

Пептиды общей формулы

где (D)A представляет собой остаток D-(N_indole-формил)триптофана;
R¹ - атом водорода или трет-бутоксикарбонильная группа либо группа вида -СО-ОХ¹, где X¹ может принимать значения: 2-алкилсульфонилэтил, 2-фенилсульфонилэтил, 2-(4-замещенный арил)сульфонилэтил;
R² = -СО-ОХ², где X² может принимать значения: 2-алкилсульфонилэтил, 2-фенилсульфонилэтил, 2-(4-замещенный арил)сульфонилэтил;
R³ и R⁴ одновременно принимают значения -CH₂-NH-CO-Y, где Y - метил, алкил C₁-C₅, фенил, замещенный фенил, либо вместе составляют дисульфидную связь;
R⁵ представляет собой атом водорода, либо группу вида -СО-ОХ³, где X³ может принимать значения: 2-алкилсульфонилэтил, 2-фенилсульфонилэтил, 2-(4-замещенный арил)сульфонилэтил.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2