Модифицированный пневмолизин, рекомбинантная плазмида, способ получения модифицированного пневмолизина, вакцина

 

Изобретение относится к генной инженерии, а именно к получению модифицированного пневмолизина и изготавливаемой на его основе вакцине. Изобретение позволяет получить нетоксичный пневмолизин с сохранением иммунной активности в вакцине. Модифицированный пневмолизин получают путем олигонуклеотид-направленного мутагенеза. Затем проводят экспрессию измененного гена пневмолизина дикого типа в бактериях E.coli. Модифицированный пневмолизин имеет определенную аминокислотную последовательность. В ней в участках 427-437, 367-398 и 257-297 осуществлены одна или несколько аминокислотных замен, делеций или блокирующих мутаций. Рекомбинантная плазмида, определяющая синтез модифицированного пневмолизина, конструируется на основе вектора рКК233-2. Содержит гены устойчивости к ампициллину и тетрациклину. Промотор trc, регулируемый с помощью изопропил--P-тиогалактопиранозида. Сайт связывания с рибосомой lac L, примыкающий к инициирующему кодону ATG. Сайты рестрикции для эндонуклеаз Pst I и Hind III. Измененный ген пневмолизина, клонированный в NCO I - сайт, имеющий определенную последовательность нуклеотидов. Вакцина, обладающая способностью вызывать иммунный ответ у животных, содержит антиген из модифицированного пневмолизина. 4 с. и 2 з.п. ф-лы, 4 ил.

Настоящее изобретение относится к мутантам токсина пневмолизина и пневмококковым вакцинам, изготовленным на основе указанных мутантов.

Предпосылки создания изобретения Streptococcus pneumoniae (пневмококк) является основным возбудителем инфекционных заболеваний, таких, как пневмония, менингит и бактериемия. Даже в тех регионах, где любой пациент может пройти курс эффективного лечения антибиотиками, смертность от болезней, вызванных пневмококком, достигает 19% для госпитализированных пациентов, и этот процент возрастает до 30-40% для пациентов с бактериемией. Такая высокая смертность зарегистрирована в США, где пневмония, вызванная S.pneumoniae, и являющаяся основной причиной летального исхода, занимает пятое место по причинам смертности. Действительно, пневмония является единственным инфекционным заболеванием, стоящим в первой десятке по причине смертности в этой стране. Процент смертности от пневмококкового менингита в США составляет 13-45%. В развитых странах, свыше 3 миллиона детей в возрасте 5 лет ежегодно умирают от пневмонии, что свидетельствует о том, что S.pneumoniae является наиболее распространенным патогеном. S.pneumoniae является также возбудителем менее серьезных, но широко распространенных заболеваний, таких, как воспаление среднего уха (отит) и синусит, которые оказывают значительное влияние на расходы по здравоохранению в развитых странах. Отиты занимают одно из важных мест среди распространенных заболеваний детей младшего возраста, и синусиды являются распространенным заболеванием как детей, так и взрослых.

В конце 70-х годов было выдано разрешение на применение вакцины в целях предупреждения серьезных инфекционных заболеваний, в частности, инфекционной пневмонии, у определенных групп пациентов, например, у которых удалена селезенка, и у детей младшего возраста, которые являются особенно восприимчивыми к быстро развивающимся пневмококковым заболеваниям. Эта вакцина состоит из очищенных капсульных полисахаридов, которые являются доминирующими пневмококковыми поверхностными антигенами. Однако, каждый серотип S.pneumoniae ( которых имеется 83) имеет структурно отличающийся капсульный полисахарид, и иммунизация с одним серотипом не дает защиты против громадного большинства других. Вакцина, применяемая в настоящее время в Австралии, состоит из полисахаридов, очищенных от 23 наиболее распространенных серотипов, которые являются причиной около 90% пневмококковых заболеваний в этой стране.

Защиту даже против тех серотипов, которые содержатся в вакцине, никоим образом нельзя считать абсолютно надежной, и было зарегистрировано несколько фактов серьезного, и даже с летальным исходом, заражения вакцинированных лиц, принадлежащих к группе повышенного риска. Наименьший эффект эта вакцина дает при прививке детям младшего возраста, и некоторые исследования, в том числе и проведенные в Аделаиде, показали, что существующие препараты, либо очень мало, либо вообще не имеют клинического эффекта для этой группы пациентов. Такая неэффективность данной вакцины, по всей вероятности, связана с низкой иммуногенностью пневмококковых полисахаридов у детей, моложе 5 лет. Авторами настоящей заявки было показано, что иммунный ответ с образованием антител является особенно низким к пяти серотипам, являющимися распространенными возбудителями заболеваний у детей (типы 6, 14, 18, 19 и 23). Действительно, образование антител к этим пневмококковым полисахзаридам приближается к "взрослому" уровню у вакцинированных детей, старше 8 лет.

Исходя из вышесказанного, можно сделать вывод, что для предупреждения заболеваний, вызванных пневмококковой инфекцией, у детей младшего возраста необходимо использовать вакцину, антигены которой не являются капсульными полисахаридами. Таким антигеном может быть пневмолизин, являющийся белковым токсином, продуцируемым всеми вирулентными изолятами S.pneumoniae. Было обнаружено, что иммунизация мышей этим белком до некоторой степени обеспечивает иммунитет от пневмококковой инфекции.

Однако основная проблема заключается в том, что пневмолизин является токсичным для человека. Поэтому, пневмолизин, содержащийся в вакцине, должен быть в основном нетоксичным. Однако придание пневмолизину нетоксичности способами, которые в основном, используются в настоящее время, может повлечь за собой изменение основной информации белка, что, в свою очередь, приведет к иммунологическому отклонению указанного пневмолизина от нативного пневмолизина или пневмолизина дикого типа. Иммунный ответ, продуцируемый изменением белком, иммуногенно отличающимся от нативного пневмолизина, будет обладать меньшей иммунной активностью или эта иммунная активность вообще будет отсутствовать. Таким образом, основная задача заключается в том, чтобы получить нетоксичный пневмолизин, который в то же время был бы иммуногенно аналогичным его токсичной форме в отношении продуцирования защищающегося иммунного ответа.

Такой модифицированный пневмолизин с указанными выше свойствами может быть затем использован для изготовления различных вакцин. Так, например, модифицированный пневмолизин может быть сам по себе использован для иммунизации, или альтернативно, указанный модифицированный пневмолизин может быть использован в виде конъюгата, с пневмококковым полисахаридом, или в качестве другой альтернативы, указанный пневмолизин может быть включен в вакцину, в которой упомянутые пневмококковые полисахариды присутствуют в виде конъюгата с другим белком, а модифицированный пневмолизин присутствует с неконъюгированной форме. Альтернативно, пневмококковый полисахарид и пневмолизин, оба могут быть использованы в неконъюгированной форме.

Описание изобретения.

В общей форме, настоящее изобретение относится к модифицированному пневмолизину, который является, в основном, нетоксичным, и который обладает способностью продуцировать иммунный ответ у животного, восприимчивого к пневмолизину дикого типа.

Предпочтительный модифицированный пневмолизин имеет более низкую активность к связыванию комплемента по сравнению с пневмолизином дикого типа. Снижение активности к связыванию комплемента способствует уменьшению воспалительной реакции в месте введения вакцины.

Предпочтительный модифицированный пневмолизин имеет более низкую активность к F_c - связыванию по сравнению с пневмолизином дикого типа. Снижение активности к F_c - связыванию способствует уменьшению воспалительной реакции в месте введения вакцины.

Предпочтительным модифицированным пневмолизином является пневмолизин, в котором по сравнению с пневмолизином дикого типа имеются замещения одной или нескольких аминокислот.

Пневмолизин может быть модифицирован таким образом, что аминокислота, присутствующая в одном или нескольких положениях аминокислотных остатков 367, 384, 385, 428, 433 или 435 пневмолизина дикого типа, является замененной, удаленной или блокированной.

Другим предметом настоящего изобретения является вакцина, включающая в себя модифицированный пневмолизин, который является нетоксичным, и при этом, обладает способностью продуцировать иммунный ответ у животного, восприимчивого к пневмолизину дикого типа.

Предпочтительная вакцина включает в себя капсульный полисахарид, конъюгированный с модифицированным пневмолизином.

Капсульный полисахаридный материал может происходить от одного или нескольких серотипов Streptococcus pneumoniae 6A, 6B, 14, 18C, 19A, 19F, 23F, 1, 2, 3, 4, 5, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 15B, 17F, 20, 22F и 33F.

В этом варианте своего осуществления настоящее изобретение может быть конкретно направлено на серотипы, которые в основном, ответственны за заболевания детей, и к которым в детском организме особенно плохо вырабатывается иммунитет (т. е. серотипы Danish 6A, 6B, 14, 18C, 19A, 19F и 23F). Однако, для синтеза, конъюгатов могут быть также использованы и другие широко распространенные серотипы, содержащиеся в имеющейся в настоящее время 23-валентной вакцине Merck Sharp Dohme и (Pneumovax 23) (т.е. типы 1, 2, 3, 4, 5, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 15B, 17F, 20, 22F и 33F) или практически любой другой серотип. Конъюгация любых пневмококковых полисахаридов с белком-носителем обеспечивает хорошую Т-зависимую иммуногенность у детей, т.е. продуцирует достаточные протективные уровни антитела против полисахарида.

Модифицированный пневмолизин в сочетании с капсульным полисахаридом обеспечивает высокую степень иммунитета, особенно против серотипов S.pneumoniae, полисахариды которых не содержатся в существующих вакцинных препаратах.

Вакцину, предпочтительно, вводят путем подкожной инъекции, в отсутствие или при наличии соответствующего адъюванта, такого как гель глинозема.

В другом варианте своего осуществления, настоящее изобретение относится к рекомбинантному клону, содержащему репликон и ДНК-последовательность, кодирующую модифицированный пневмолизин; причем указанный пневмолизин является нетоксичным и обладает способностью продуцировать иммунный ответ у животного, восприимчивого к пневмолизину дикого типа.

В следующем варианте своего осуществления, настоящее изобретение относится к способу получения модифицированного пневмолизина, включающего в себя стадию очистки указанного модифицированного пневмолизина из экспрессирующей системы, содержащей рекомбинантный клон с ДНК, кодирующей модифицированный пневмолизин, который является, в основном, нетоксичным, и который обладает способностью вырабатывать иммунный ответ у животного, восприимчивого к пневмолизину дикого типа.

Предпочтительной системой экспрессии является культура клеток-хозяев, включающая в себя рекомбинантный клон с ДНК, кодирующей модифицированный пневмолизин.

Еще в одном варианте своего осуществления, настоящее изобретение относится к способу получения вакцины, включающему в себя стадию амплификации рекомбинантного клона, кодирующего модифицированной пневмолизин, транскрипцию и трансляцию указанного клонированного материала, очистку модифицированного пневмолизина, и стадию конъюгата измененного пневмолизина и капсульного полисахарида, причем указанный измененный пневмолизин имеет, в основном, более низкую токсичность по сравнению с пневмолизином дикого типа.

Для лучшего понимания настоящего изобретения, настоящее описание сопровождается следующими иллюстрациями: Фиг. 1 - ДНК - последовательность гена, кодирующего пневмолизин дикого типа; Фиг. 2 - ДНК-последовательность модифицированного гена, кодирующего пневмолизин дикого типа, используемый для клонирования гена пневмолизина в экспрессирущий вектор, Фиг.3 - аминокислотная последовательность пневмолизина дикого типа, происходящего от ДНК-последовательности гена, кодирующего пневмолизин дикого типа, и Фиг. 4 - аминокислотная последовательность пневмолизина, где показаны замещения аминокислот, осуществленные с помощью сайт-направленного мутагенеза.

В целях конструирования нетоксичных производных пневмолизина, приемлемых для введения человеку, использовали технологию рекомбинантных ДНК. Для достижения указанной цели, ген S.pneumoniae, кодирующий пневмолизин, клонировали в Escherichia coli и определяли полную ДНК-последовательность. Эта ДНК-последовательность показана на фиг.1, а происходящая от нее аминокислотная последовательность показана на фиг.3.

Три области гена пневмолизина подвергали олинонуклеотиднаправленному мутагенезу. Первая область кодирует аминокислоты 427 - 437 в последовательности белка, и указана на фиг.3 (подчеркнута). Эта последовательность из 11 аминокислот является абсолютно гомологичной аналогичным областям других родственных активированных токсинов, которые, очевидно, являются ответственными за гемолитическую активность, а следовательно, и токсичность токсина. Две другие области кодируют аминокислоты 257 - 297 и аминокислоты 368 - 398, которые также показаны на рис.3 (подчеркнуты). Эти две области токсина имеют аминокислотную последовательность, гомологичную человеческому C-реактивному белку (ЦРБ), в результате чего можно сделать вывод, что указанные области ответственны за способность пневмолизина к связыванию с F_c - областью иммуноглобулинов и активации комплемента. Было построено 15 отдельных мутаций в гене пневмолизина, результатом чего явились лишь аминокислотные замены, как показано на фиг. 4. Для сохранения структуры модифицированного пневмолизина были сделаны консервативные замены таким образом, чтобы аминокислоты замещались аминокислотами такой же природы.

Для области с гемолитической активностью, каждое замещение Cys₄₂₈_ Gly, Cys₄₂₈_ Ser, Trp₄₃₃_ Phe, Glu₄₃₄_ Asp, и Tvp₄₃₅_ Phe снижало гемолитическую активность на 97%, 90%, 99%, 75% и 90%, соответственно. Другие мутации в этой области не влияли на гемолитическую активность. Осуществление мутаций в отдельной области токсина, которая, очевидно, ответственна за связывание с мембранами клеток-мишеней, также влияет на гемолитическую активность белка. Это замещение, His₃₆₇_ Avg, полностью ингибирует гемолитическую активность. То есть, было совершенно неожиданно обнаружено, что замещение His₃₆₇_ Arg дает более высокое ингибирование гемолитической активности, чем замещения, осуществленные в области из 11 аминокислот, которая, считается ответственной за указанную активность.

Было исследовано влияние мутаций в ЦРБ-подобных областях на их способность к активации комплемента. Замещения Tvp₃₇₉_ Phe, Tyv₃₈₄_ Phe, Asp₃₈₅_ Asu и Tvp₃₉₇_ Phe показали снижение активации комплемента на 20%, 70%, 100% и 15%, соответственно. Другие мутации в ЦРБ - подобных областях, показанные на фиг.4, не обнаруживали снижения активации комплемента.

В этой связи необходимо отметить, что вышеупомянутые мутации, которые оказывают влияние либо на гемолитическую активность, либо на активацию комплемента, не оказывают неблагоприятного воздействия на иммуногенность белков по сравнению с иммуногенностью нативного пневмолизина или пневмолизина дикого типа.

Таким образом, хотя His₃₆₇_ Arg является предпочтительной мутацией для снижения гемолитической активности, однако, с помощью комбинации двух или нескольких мутаций, способствующих снижению гемолитической активности, также могут быть достигнуты очень высокие уровни снижения гемолитической активности. Аналогично, хотя Asp₃₈₅_ Asu является предпочтительной мутацией для снижения активации комплемента, однако, при этом может быть также использована комбинация двух или нескольких других мутаций, способствующих снижению активности в меньшей степени.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, дериват пневмолизина, предназначенный для использования в изготовлении вакцины, включает в себя комбинацию нескольких из вышеуказанных мутаций, таких, которые обеспечивали бы ингибирование способности белка к активации комплемента при нулевой гемолитической активности. Примерами таких комбинаций являются: Хотя указанные комбинации являются предпочтительными, однако, следует отметить, что для использования модифицированного пневмолизина при изготовлении вакцины, могут быть взяты и другие комбинации мутаций. Кроме того, модифицированный пневмолизин может содержать любую одну из отдельных мутаций с достаточно сниженной активностью.

Высокий уровень экспрессии модифицированного пневмолизина из ДНК, кодирующей модифицированный пневмолизин, может быть достигнут с помощью любого из существующих стандартных способов экспрессии, таких как экспрессия в прокариотическом хозяине, содержащем ДНК, клонированную соответствующим образом в одном из многочисленных векторов экспрессии, используемых специалистами, или клонированную соответствующим образом в хозяйской хромосоме; экспрессия в эукариотическом хозяине, содержащем ДНК, клонированную соответствующим образом либо в векторе экспрессии, либо в хозяйской хромосоме, либо в системе экспрессии in vitro, такой, которая может включать в себя очищенные компоненты, необходимые для экспрессии модифицированного пневмолизина.

В целях достижения высокого уровня экспрессии мутантного гена пневмолизина, он может быть клонирован в векторе pKК233-2 для экспрессии в Esherichia coli или в другом подобном прокариоте. Этот вектор включает в себя гены устойчивости к ампициллину и тетрациклину, trc - промотор, который может быть регулирован IPTG (изопропил--D - тиогалактопиранозидом), и сайт связывания с рибосомой lac L, примыкающий к инициирующему кодону ATG, вводящему сайт рестрикции N col. Непосредственно за (ниже) инициирующим кодоном находятся сайты для рестриктаз Pst I и Hind III, за которыми следует сильный терминатор транскрипции T₁T₂. Перед введением в pKK233-2, сайт рестрикции N col. конструктирован 5' - конца пневмолизин - кодирующий последовательности (у инициируемого кодона) с помощью олигонуклеотид - направленного мутагенеза, как показано на фиг.2. Это дало возможность ближайший конец модифицированного гена пневмолизина клонировать в N col. - сайт pKК233-2, а - сайт состоящий приблизительно из 80 оснований и расположенный ниже кодона терминации гена пневмолизина, использовали для удаления дистального конца модифицированного гена в совместимый сайт в pKK233-2. Мутантный дериват пневмолизина может быть, однако, клонирован в любую из многочисленных систем высокоэкспрессирующих векторов.

Мутантный пневмолизин получали следующим образом: клетки E.coli, содержащие вышеупомянутую рекомбинатную плазмиду, сначала культивировали в 9 литрах культуры в среде Luria Bertani (или в другой подходящей среде), дополненной соответствующим антибиотиком, при 37^oC и при аэрации. Когда культура достигала позднюю логарифмическую фазу роста, к ней добавляли IPTG до конечной концентрации 20 мкМ (для индуцирования экспрессии модифицированного гена пневмолизина), и продолжали инкубацию еще 2-3 часа.

Затем клетки собирали путем центрифугирования или ультрафильтрации, и подвергали лизису путем обработки ЭДТК и лизоцимом с последующей обработкой ультразвуком, или путем разрушения клеток в камере давления French. Клеточный дебрис удаляли путем центрифугирования, после чего экстракт экстенсивно диализовали против 10 мМ фосфата натрия (pH 7,0). Затем материал загружали в колонку с ДЭАЭ-целлюлозой и элюировали линейным градиентом (10-250 мМ) фосфата натрия) pH 7,0) Фракции, содержащие пиковые уровни деривата пневмолизина, собирали, концентрировали с помощью ультрафильтрации, и загружали в колонку с Сефакрилом S-200. Колонку проявляли в 50 мМ фосфата натрия (pH 7,0), и снова фракции с высокими уровнями деривата пневмолизина собирали, концентрировали путем ультрафильтрации, и хранили в 50% глицерине при -15^oC. Конечный продукт (по оценке, проведенной с помощью электрофореза в полиакриламидном геле с ДДС-Na) имел чистоту свыше 95%. В качестве альтернативной очистки может быть использована хроматография на фенил-сефарозе с использованием гидрофобных взаимодействий. Однако в связи с этим следует отметить, что в соответствии с настоящим изобретением могут быть использованы и другие альтернативные методы очистки модифицированного пневмолизина, например, метод очистки с помощью жидкостной хроматографии высокого давления.

Этот очищенный модифицированный пневмолизин может быть затем введен в соответствующем количестве либо в виде вакцины, либо непосредственно в чистом виде или в сочетании с другими антигенами. Указанный пневмолизин может быть также введен в виде конъюгата с полисахаридом, происходящим от одного или нескольких пневмококковых штаммов, описанных выше.

Мутантный пневмолизин может быть конъюгирован с различными серотипами полисахарида несколькими способами. Один из них заключается в том, что активированный полисахарид получают путем обработки чистого полисахарида (коммерчески доступного) бромистым цианом и дигидридом адипиновой кислоты (ADH) Затем ADH - полисахарид объединяют с мутантным пневмолизином в присутствии I-этил-3 (3-диметиламинопропил) карбодиимид-HCl. После чего конъюгированный материал выделяют из реагентов с помощью хроматографии на Сефарозе CL-4B.

Альтернативно, конъюгаты полисахарида и мутантного пневмолизина могут быть получены с использованием бифункциональных реагентов, таких как N-сукцинимидил-6-(4'-азидо-2'нитрофениламино) гексаноат (SANPAH). Чистый полисахарид растворяют в фосфатно-солевом растворе и подвергают взаимодействию с SANPAH в присутствии сильного источника белого света. Непрореагировавший SANPAH затем выделяют из активированного полисахарида с помощью хроматографии на Сефадексе C 50. После чего активированный полисахарид подвергают конъюгированию с мутантным пневмолизином в 0,2 М боратного буфера (pH 8,5) Затем избыток реактивных групп блокируют лизином и полисахарид - белковый конъюгат выделяют из других реагентов с помощью хроматографии на Сефарозе CL-4B. Конъюгаты могут быть также получены путем гидроаминирования с использованием цианоборогидрида.

Альтернативно, другой белок, такой как инактивированный столбнячный токсин, может быть конъюгирован с предпочтительными полисахаридами, а модифицированный пневмолизин может быть добавлен в вакцину в неконъюгированном виде.

В настоящем описании представлен предпочтительный способ осуществления настоящего изобретения, однако, возможны и другие его варианты, не выходящие за рамки нижеследюущей формулы изобретения.

Формула изобретения

1. Модифицированный пневмолизин Streptococcus pheumonial, способный индуцировать антительный иммунный ответ у животных, восприимчивых к пневмолизину дикого типа, обладающий уменьшенной способностью к связыванию комплемента и пониженной гемолитической активностью, полученный путем олигонуклеотид-направленного мутагенеза и экспрессии измененного гена пневмолизина дикого типа в бактериях E.coli, имеющий следующую аминокислотную последовательность I, в которой в участках 427 - 437, 367 - 398 и 257 - 297 осуществлены одна или несколько аминокислотных замен, делеций или блокирующих мутаций.

2. Пневмолизин по п.1, отличающийся тем, что имеет следующую аминокислотную последовательность II, где R₁ является His или Arg, R₂ - Trp или Phe,
R₃ - Tyr или Phe,
R₄ - Asp или Asn,
R₅ - Trp или Phe,
R₆ - Cys, Gly или Ser,
R₇ - Trp или Phe,
R₈ - Clu или Asp,
R₉ - Trp или Phe
и где по крайней мереодин из остатков R₁, R₆, R₇, R₈ или R₉ отличается от присутствующего у дикого типа.

3. Пневмолизин по п.1 или 2, отличающийся тем, что R₁ является Arg, R₂ - Trp, R₃ - Tyr, R₄ - Asn, R₅ - Trp, R₆ - Cys, R₇ - Trp, R₈ - Glu и R₉ является Trp.

4. Рекомбинантная плазмида, сконструированная на основе вектора рКК 233-2 и определяющая синтез модифицированного пневмолизина, охарактеризованного в любом из пп.1 - 3 формулы, характеризующаяся следующими признаками:
содержит гены устойчивости к ампициллину и тетрациклину,
trc - промотор, регулируемый с помощью изопропил --тиогалактопиранозида,
сайт связывания с рибосомой lacL, примыкающий к инициирующему кодону ATG,
сайты рестрикции для эндонуклеаз Pst и Hind III,
измененный ген пневмолизина, клонированный в Nco I-сайт имеющий следующую последовательность III нуклеотидов.

5. Способ получения модифицированного пневмолизина Streptococcus pheumonial, охарактеризованного в любом из пп.1 - 3 формулы, заключающийся в том, что ген пневмолизина дикого типа подвергают олигонуклеотид-направленному мутагенезу, встраивают измененный ген в вектор рКК 233-2 с получением рекомбинантной плазмиды, которой трансформируют бактерии Escheriehia coli, выращивают трансформированные бактерии в питательной среде и выделяют из них модифицированный пневмолизин.

6. Вакцина, обладающая способностью вызывать иммунный ответ у животных, восприимчивых к пневмолизину дикого типа, отличающаяся тем, что содержит антиген из модифицированного пневмолизина, охарактеризованного по пп.1 - 3.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8