Способ получения противоракового препарата

 

Изобретение относится к микробиологии, а именно к способу получения противоракового препарата. В основу настоящего изобретения положена задача упрощения способа, повышения его экономичности и повышения активности и чистоты целевого продукта. Способ получения противоракового препарата включает культивирование бактерий Bacillus thuringiensis , растворение действующего начала, повторное его осаждение и высушивание. Новым в способе является то, что действующее начало растворяют в едкой щелочи, причем растворение осуществляют непосредственно из споро - кристаллического комплекcа в составе бактериальной биомассы, осадок удаляют, а действующее начало осаждают концентрированной уксусной кислотой, в качестве растворителя используют едкие щелочи, например, гидроксиды натрия или калия, при соотношении объемов 1:10 - 1: 15.

Изобретение относится к микробиологии, а именно, к способу получения противоракового препарата.

Известен способ получения препарата, обладающего противораковой активностью, на основе штамма, Bacillus thuringitnsis subsp. israensis /Yakoyama Y. et. Potentiation of the cytotoxic activity of anti cancer drugs adainst cultured L 1210 ce //S. //Chem. Pharm. Bu//. 1988 V.36. - p.4499 4505, включающий глубинное культивирование штамма, отделение биомассы центрифугированием и разложение молекул дельта-эндотоксина до полипептидов. В известном способе разложение эндотоксина осуществляют после лиофильного высушивания биомассы с помощью щелочного раствора, содержащего глицин, гидроксид натрия и 2-меркаптоэтанол, в течение 17ч с последующим разделением на активную и неактивную фракции целюллозно-колоночной хроматографией, что снижает активность получаемого препарата, его выход и значительно усложняет и удорожает процесс.

Наиболее близким по технической сущности к достигаемому положительному эффекту /прототипом/ к заявляемому является способ получения препарата, обладающего противоопухолевой активностью, включающий получение биомассы глубинным культивированием, Bacillus thuringinsis var. thuringiensis, отделение бактериальной биомассы от питательной среды и разложение дельта-эндотоксина до полипептидов.

В известном способе разложение дельта-эндотоксина до полипептидных компонентов осуществляется УФ облучением после выделения спор и кристаллов из биомассы путем флотации с последующим разделением в двухфазной системе: четыреххлористый углерод водный раствор натрия сернокислого. В получаемом известным способом продукте кроме действующего начала, а именно, дельта-эндотоксина и белка оболочки споры, содержится большое количество неактивного спорового материала /белки тела споры, нуклеиновые кислоты и другие биополимеры/, составляющего около 90% массы спор, что приводит к снижению чистоты и активности продукта. Применение флотации и двухфазного разделения снижает выход продукта, усложняет и удорожает способ и увеличивает его длительность. Использование метода облучения требует специального сложного оборудования, известный способ, кроме того, осуществляется с использованием токсического вещества, а именно, четыреххлористого углерода.

В основу настоящего изобретения положена задача упрощения способа, повышения его экономичности и получения более чистого и активного целевого продукта.

Поставленная задача решается тем, что в известном способе получения препарата, обладающего противоопухолевой активностью, включающего получение биомассы культивированием штамма Bac. thuringiensis, растворение дельта-эндотоксина в споро-эндотоксиновой смеси едкой щелочью при перемешивании, удаление образовавшегося осадка и осаждение из раствора активных полипептидов дельта-эндотоксина концентрированной уксусной кислотой и высушивание, согласно изобретению, из штаммов используют штаммы Bac. thuringiensissulesp. sotto или subsp. alesti.

В предлагаемом способе получения противоракового препарата в культуральную биомассу, содержащую споры, дельта-эндотоксин и вегетативные клетки, добавляют в качестве растворителя едкую щелочь, выдерживают, перемешивая, до растворения действующего начала, а именно, дельта-эндотоксина и белка оболочки споры, и удаляют осадок, причем из едких щелочей используют гидроксид натрия или калия в соотношении объемов к активной фракции 1:10 или 1:15. Добавление гидроксида в активную фракцию позволяет растворить действующее начало целевого продукта, а именно, дельта-эндотоксин и белок оболочки споры, гомологичный эндотоксину по составу, физико-химическим свойствам и биологической активности. Отделение осадка, полученного после растворения и представляющего собой элементы культуральной среды, вегетативные клетки, лишенные оболочки споры, продукты метаболизма бактерии, позволяет получить практически чистый раствор действующего начала, то есть полипептидов эндотоксина, что повышает активность целевого продукта и позволяет избежать возможных побочных эффектов при его применении, обусловленных наличием посторонних примесей. Последующее осаждение полипептидов из щелочного раствора титрованием уксусной кислотой до рН 4 позволяет дополнительно повысить чистоту целевого продукта. Осадок высушивают.

Наиболее полно сущность предлагаемого технического решения поясняется описанием конкретных примеров его осуществления.

Пример 1. Культивирование Bak. thuringiensis subsp. sotto штамм 617 осуществляли на твердой питательной среде в термостате при температуре 28^oC. 30^oС в течение 10 дней. После этого культуру промывали дистиллированной водой, физиологическим раствором и снова дистиллированной водой, освободив тем самым от растворимых метаболитов.

Для разложения молекул, образующих кристаллы дельта-эндотоксина, до полипептидов в споро-дельта-эндотоксиновую смесь добавляли растворитель гидроксид натрия в соотношении объемов 1:10, т.е. на 1 кг смеси 10 л 0,16% гидроксида натрия, и выдерживали до растворения кристаллов дельта-эндотоксина в течение 2 ч при перемешивании. При этом растворяется и белок спор, причем до полипептидов, сходных с полипептидами, до которых разлагается дельтаэндотоксин.

Осадок, включающий элементы культуральной среды, вегетативные клетки, лишенные оболочки споры и т.п. удаляли центрифугированием в течение 20 мин при скорости вращения ротора 5000 об/мин. Возможно удаление осадка любым другим способом, например, фильтрацией, сепарацией и др. Для повышения чистоты действующего начала полипептидов эндотоксина, их осаждали титрованием концентрированной уксусной кислотой до рН 4. Осадок высушивали.

Полученный целевой продукт имеет выход дельта-эндотоксина 168,7 9,7 г/кг сухого веса культуры.

Пример 2. Технология аналогична примеру 1, но в качестве штамма использовали Bac. thuringiensis subsp. alesti N 204.

Выход целевого продукта составил 142,2 7,6 г/кг сухого веса культуры.

Пример 3. Технология аналогична примеру 1, но в качестве растворителя использовали гидроксид натрия в соотношении объемов 1:15.

Пример 4. Технология аналогична примеру 1, но в качестве растворителя использовали гидроксид калия в соотношении объемов 1:10 или 1:15. Использование объемов едкой щелочи ниже, чем 1:10, нецелесообразно, т.к. не позволяет полностью растворить действующее начало, что снижает выход целевого продукта, а больше, чем 1:15 приводит к непроизводительному расходованию щелочи и уксусной кислоты.

Противораковую активность препарата на основе дельта-эндотоксина Bac. thuringiensis, полученного предлагаемым способом, проверяли на культурах раковых клеток НеLа и НеР. Для этого все операции способа проводили в стерильных условиях, используя стерильные вещества, растворы и оборудование. Для предотвращения нежелательного цитотоксического влияния рН раствор препарата дельтаэндотоксина титровали стерильным раствором 0,1 М НС1 до рН 8 и разбавляли стерильным буфером следующего состава: 0,8% NаС1; 0,02% КС1; 0,115% NаНРО₄; 0,02. КН2РО₄4; вода остальное, имеющим рН 7,5.

Концентрация дельта-эндотоксина в растворе составляла 0,025; 0,50; 0,075 мг/мл. Раковые клетки инкубировали при 28^oС с раствором эндотоксина /целевого препарата/ в течение 1,5; 10; 15; 20 мин; 1,2; 3; 6; 9, 12, 24, 48 ч. После этого клетки осторожно промывали стерильным буферным раствором, фиксировали и исследовали методами световой, электронной сканирующей и трансмиссионной микроскопии. В качестве контроля использовали препараты, полученные из клеток, которые инкубировали в течение тех же периодов времени, что и в опыте, но в буферном растворе указанного выше состава в отсутствие дельта-эндотоксина.

Исследование показало, что раковые клетки разрушались под действием дельта-эндотоксина и оставались неизменными в контроле при инкубации с буферным раствором в течение всего эксперимента. При концентрации эндотоксина 0,050 мг/мл изменения клеток наблюдали уже через 1 мин инкубации. Клетки вакуолизировались, причем степень вакуолизации увеличивалась с увеличением продолжительности инкубирования и достигала максимального значения через 15 мин. Через 15 мин инкубации обнаружили первые признаки разрушения клеток: мембраны клеток были сильно истончены, ядра приобретали зернистость при изучении под световым микроскопом, митохондрии имели очень вакуолизированные кристы и сокращенный, плотный для электронов матрикс, эндоплазматический ретикулум также очень вакуолизирован /данные электронной трансмиссионной микроскопии/. Изучение методом сканирующей микроскопии дало возможность проследить изменение внешнего вида клетки. Через 15 мин инкубации клетки становились практически гладкими, исчезала складчатость и бугристость, свойственная контрольным клеткам, увеличивался их объем, что связано с вакуолизацией. Следствием вакуолизации явилось механическое разрушение мембраны /разрывы/.

Каких-либо изменений раковых клеток в контроле не наблюдали. Не наблюдали описанных выше цитотоксических эффектов и при инкубации нормальных эмбриональных культуральных клеток, инкубированных в присутствии дельта-эндотоксина в описанных выше условиях.

Полученные в описанном эксперименте результаты были абсолютно одинаковыми для обоих штаммов Bac. thuringiensis subsp. sotto N 617 и subsp.alesti N 204, и зависели только от концентрации дельта-эндотоксина, что согласуется с существующими представлениями о тождественности эндотоксинов различного происхождения, т.к. установлено, что нет сколько-нибудь значительных различий в эндотоксинах, продуцируемых разными штаммами различных подвидов бактерии, и они очень близки по своему аминокислотному составу, строению и физико-химическим свойствам /Chestukhina v. et al. Jhe main features jf Bac. thuringiensis b endotoxin moleculfr structure // Arch. microbiol. 1982. - V.132. p. 159 162/.

Препарат, полученный предлагаемым методом, исследовали также в научно-исследовательской лаборатории нетрадиционных методов лечения рака при горонкодиспансере г.Барнаула. Лечение применяли для неоперабельных или отказавшихся от операции больных и по их просьбе. Установлено, что препарат способствует восстановлению Т- и В-лимфоцитов, активации макрофагального звена. Наблюдали снижение уровня опухолевых маркеров МСА: СА-125 и СА-19.9. Снижение было стойким и длилось не менее полугода после окончания приема препарата. Наблюдали разрушение опухолей и метастазов. Так например, больная Г. 46 лет, находилась под наблюдением онколога с 1986 г. с диагнозом рак правой молочной железы 111^б стадии. Состояние после химиолучевого лечения. От предложенной операции отказалась. До января 1991 г. чувствовала себя удовлетворительно. В январе 1991 г. обратилась в онкодиспансер с жалобами на боли в шейном отделе позвоночника и левого тазобедренного сустава. При рентгенологическом исследовании в костях таза обнаружены одиночные метастазы. От предложенного химиолучевого лечения отказалась. С 21.01.91 г. самостоятельно стала принимать по 80 мг препарата ежедневно на ночь /пациентка является сотрудником горонкодиспансера/. Данное лечение продолжала 3О дней без перерыва / общая курсовая доза составила 2400 мг /. В конце указанного периода боли в костях значительно уменьшились. Общий анализ крови от 26.02.91: лейкоциты 2,9^o10⁹/л; гемоглобин 118 г/л; СОЭ 24 мм/ч. При рентгенологическом исследовании от 01.03.91 в позвоночнике метастазов не обнаружено, в области лизиса метастазов опухоли в костях таза выявлена оссификация. С 27.05.91 по 30.06.91 больная провела аналогичное лечение /по 80 мг ежедневно до суммарной курсовой дозы 2400 мг/. Общий анализ крови от 03.07.91: лейкоциты 2,610⁹/л; гемоглобин 111 г/л; СОЭ 24 мм/ч. В последующем больная принимала лекарственные травы, специального лечения не принимала. Контрольный осмотр от 10.02.93: жалоб не предъявляет, рентгенологическое обследование в зоне ранее выявленных костных метастазов показало полное восстановление костной структуры. Болевых ощущений нет.

Использование предлагаемого препарата позволило обеспечить достижение лечебного эффекта и исключить побочные нежелательные явления.

Таким образом, предлагаемый способ получения противораковых препаратов позволяет получить целевой продукт с высокой противораковой активностью вследствие обычного растворения и выделения из состава активной фракции ее действующего начала, а именно, дельта-эндотоксина, в едкой щелочи из споро-эндотоксинового комплекса, и простого осаждения уксусной кислотой, обеспечивающего повышение чистоты целевого продукта, что значительно удешевляет и упрощает способ /за счет сокращения числа операций, отсутствия специального оборудования и т.п./.

Формула изобретения

1. Способ получения противоракового препарата путем культивирования бактерий вида Bacillus thuzingiensis, отделения биомассы, содержащей споро-дельта-эндотоксиновый комплекс, с последующим разложением дельта-эндотоксина до полипептидов и их выделением, отличающийся тем, что в биомассу вносят едкую щелочь, разложение дельта-эндотоксина проводят путем выдерживания смеси до растворения кристаллов эндотоксина, образующийся при этом осадок удаляют, а из раствора осаждают полипептиды дельта-эндотоксина концентрированной уксусной кислотой, осадок отделяют и высушивают.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что из щелочи используют гидроксид калия или гидроксид натрия при соотношении с биомассой 10-15:1.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанную кислоту добавляют до достижения рН 4.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что из бактерий вида Bacillus thuringiensis используют подвиды subsp.sotto или subsp.alesti.