Способ специфического лечения сапа у чувствительных животных

 

Использование: медицина, специфическое лечение сапа, предотвращение развития у млекопитающих заболевания сапом. Сущность изобретения: белок, выполняющий порообразующую функцию в клеточных стенках Pseudomonas mallei, очищенный от цитоплазматических белков и пептидогликана, с молекулярной массой 37 - 40 кД вводят подкожно чувствительным к сапу животным из расчета 100 - 30000 мкг белка на 1 кг массы животного. Через 12 - 24 ч введение белка повторяют. Лечение осуществляют как минимум в течение двух суток после заражения или до исчезновения клинических проявлений заболевания при развившейся сапной инфекции. Способ обеспечивает 100% выживание золотистых хомячков, зараженных подкожно 10 - 20 смерительными дозами агаровой культуры высоковирулентного штамма P. mallei и 52% золотистых хомяков с развившейся сыпной инфекцией при 100%-ной гибели нелеченных животных. 2 табл.

Изобретение относится к медицине, в частности к способам специфического лечения, и может быть использовано для предотвращения развития у млекопитающих заболевания сапом.

Задачей изобретения является блокирование проникновения P. mallei в клетки млекопитающих.

Решение задачи достигается путем введения чувствительным к возбудителю сапа млекопитающим белков, выполняющих порообразующую функцию в клеточных стенках сапного микроба.

Изобретение основано на впервые обнаруженной авторами способности пориновых белков из Р. mallei останавливать развитие сапной инфекции.

Сущность предлагаемого способа заключается в следующем.

Пориновые белки, очищенные от цитоплазматических белков и пептидогликана, вводят подкожно чувствительным к сапу животным (в наших опытах золотистые хомячки) из расчета 100.30000 мкг белка на кг массы животного. Через 12-24 ч введение белка повторяют. Лечение осуществляют как минимум в течение 2-х суток после заражения или до исчезновения клинических признаков заболевания (при развившейся сапной инфекции). Для определения протективного эффекта выполняют подкожное заражение животных вирулентной культурой Р. mallei в количествах, достаточных для их гибели. В течение 30 сут ежедневно фиксируют число павших животных. При заражении культурой вирулентного штамма Р. mallei выживаемость животных зависит от дозы и кратности введения препарата. Способ обеспечивал выживание до 100% золотистых хомяков, зараженных подкожно 10-20 смертельными дозами агаровой культуры высоковирулентного штамма Р. mallei. Ц-5.

Существенным признаком заявляемого изобретения является использование в качестве лечебного средства белка, выполняющего порообразующую функцию в клеточных стенках возбудителя сапа. Между существенным признаком заявляемого объекта и достигаемым техническим результатом существует причинно-следственная связь, а именно избирательное связывание введенных млекопитающему поринов с специфическими рецепторами узнаваемыми Р. mallei на поверхности эукариотических клеток, приводит к нарушению адгезии бактерий к наружной части плазматической мембраны клеток эукариот. В результате происходит нарушение процесса проникновения бактерий во внутрь клеток млекопитающих, что вызывает их гибель и предотвращает развитие инфекционного процесса.

Препараты пориновых белков, выделенные из возбудителя сапа, не обладают токсическим действием в отношении золотистых хомяков в дозах 30 мг/кг массы животного. Обнаружение способности у пориновых белков, выделенных из клеток возбудителей сапа, предотвращать и излечивать заболевание, вызываемое Р. mallei, позволяет их использовать для экстренной специфической профилактики и лечения данного заболевания и в частности вызываемого антибиотикоустойчивыми штаммами Р. mallei.

Возможность осуществления изобретения показана следующими примерами.

П р и м е р 1. Выделение пориновых белков из культуры штамма Р. mallei Ц-5.

Для выделения пориновых белков использовался способ, разработанный Новиковой О. Д. для псевдотуберкулезного микроба (Новикова О. Д. Порообразующий белок из внешней мембраны Yersinia pseudotuberculosis. Химическая характеристика и биологическая активность: Дис. канд. биол. наук. Владивосток, 1986).

Способ заключается в следующем.

К 6 г ацетон высушенных клеток возбудителя сапа добавляют 600 мл охлажденного физиологического раствора и в течение 2 ч клетки суспендируют на магнитной мешалке при температуре (42)^оС. Затем их осаждают центрифугированием в течение 45 мин при 600 g. Осадок суспендируют в 200 мл 0,03 М трис-НСl буфера (рН 7,2) (далее буфер А), содержащего 2% тритона Х-100, и экстрагируют при (42)^оС в течение 2 ч при интенсивном перемешивании. Осадок отделяют центрифугированием при 20000 g в течение 15 мин, промывают буфером А, суспендируют в 200 мл буфера, добавляют 2 мл 1 М раствора MgCl₂ и 10 мг ДНК-азы (Реахим НРО "Биохимреактив") и инкубируют 12 ч.

Осадок отделяют центрифугированием при 20000 g в течение 30 мин, промывают буфером А, суспендируют в 150 мл буфера А, содержащего 2% додецилсульфата натрия, и экстрагируют при температуре (601)^оС в течение 15 мин. Комплекс пептидогликан-белок отделяют центрифугированием при 45000 g в течение 1 ч.

Осадок промывают водой, суспендируют его в 100 мл буфера А, содержащего 0,5% додецилсульфата натрия и 0,5 М NaCl, выдерживают при (370,5)^оС в течение 30 мин. Затем осадок отделяют центрифугированием при 100000 g в течение 30 мин. Суспендируют его в 50 мл буфера А, содержащего 2% додецилсульфата натрия, и кипятят на водяной бане 10 мин.

Осадок отделяют центрифугированием при 150000 g в течение 1 ч. Далее очистку ведут гельфильтрацией в сефакриле S-200 или другом носителе. Порин сапа представляет собой гидрофобный белок с молекулярной массой 37-40 килодальтон. В реакции диффузионной преципитации с диагностическими сыворотками к возбудителю сапа образует одну четкую линию.

П р и м е р 2. Определение протективного эффекта для золотистых хомяков.

Выбор золотистых хомяков для опытов по оценке протективного эффекта порина из P. mallei обусловлен их очень высокой чувствительностью к данному возбудителю.

Опыт 1. Доказательство способности порина P. mallei предотвращать заболевание сапом.

Условия выполнения опыта и его результаты приведены в табл. 1.

Данные, приведенные в табл. 1, показывают высокий защитный эффект порина, выделенного из P. mallei. Отсутствие протективного эффекта у порина, выделенного из возбудителя мелиоидоза, свидетельствует о специфичности протективного действия пориновых белков. Интерес представляет и тот факт, что 100%-ная гибель животных происходит только в тех случаях, когда порин введен либо в 1-е сутки, либо через сутки. Число павших животных резко уменьшается, если порин вводят в течение первых двух суток. По-видимому, продолжительность связывания поринами сайтов на поверхности клеток макроорганизма, необходимых для узнавания, не превышает одних суток, в то же время циркулирование возбудителя заболевания в крови золотистых хомяков при отсутствии условий для проникновения внутрь клеток (персистирования) не превышает двух суток. Очевидна и зависимость лечебного эффекта от дозы вводимого препарата.

Опыт 2. Доказательство специфического лечебного действия порина, выделенного из Р. mallei.

Условия выполнения опыта и его результаты приведены в табл. 2.

Данные, приведенные в табл. 2, показывают, что возможно специфическое блокирование развития сапной инфекции пориновым белком, выделенным из Р. mallei. Практически 100% -ная гибель больных животных, леченных поринами из близкородственных микроорганизмов (возбудители мелиоидоза и псевдомоноза), а также S. typhimurium, свидетельствует о специфическом лечебном действии порина Р. mallei.

Формула изобретения

СПОСОБ СПЕЦИФИЧЕСКОГО ЛЕЧЕНИЯ САПА У ЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ путем введения лечебного препарата, отличающийся тем, что в качестве лечебного препарата используют пориновый белок с мол. м. 37 40 кД, выделенный из пептидогликанового комплекса бактерий Pseudomonas mallei, при этом введение осуществляют по крайней мере в течение двух суток после заражения или до исчезновения клинических признаков заболевания, если лечение начато при развившейся сапной инфекции.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2