Штамм бактерий bacillus stearothermophilus - продуцент эндонуклеазы рестрикции, способной узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5`- cc (a / t) gg - 3`

 

Использование: микробиология и биотехнология. Сущность изобретения: предложен новый штамм бактерий Bacillus stearothermophilus ВКПМ В - 5465 - продуцент эндонуклеазы рестрикции, способной узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5-CC(A/T)GG-3. Штамм выделен из термальных источников в результате поиска продуцентов рестриктаз. Выход фермента составляет 100000 ед./г сырой биомассы, удельная активность целевого фермента составляет 30000 ед./мл. Рестриктаза Bst 381 является изошизомером рестриктазы Bst Gii и может заменить последнюю во всех генно-инженерных работах. 1 ил.

Изобретение относится к микробиологической промышленности и генной инженерии и касается получения нового штамма, продуцирующего сайт-специфическую эндонуклеазу, способную узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5'-CC(A/T)GG-3'.

Рестриктаза такой специфичности может быть использована для исследования первичной структуры ДНК, физического картирования различных геномов. Данная эндонуклеаза является удобной моделью для излучения специфичности белок-нуклеиновых взаимодействий.

Известен штамм Escherichia coli, продуцирующий рестриктазу EcoR II (сайт узнавания 5'-CC(A/T)GG-3') [1] Данная рестриктаза не является термостабильной, выход фермента не превышает 2000 ед/г сырой биомассы. Культуральные и биотехнологические свойства штамма не опубликованы.

Известен штамм Bacillus sphaericus, продуцирующий рестриктазу BshG I (сайт узнавания 5'-CC(A/T)GG-3').

Недостатком данного штамма является термолабильность эндонуклеазы рестрикции. Оптимальная температура работы фермента 37^оС [2] Наиболее близким к предлагаемому является штамм Bacillus stearothermophilus G3, продуцирующий рестриктазы BstG I и BstG II (сайт узнавания 5'-CC(A/T)GG-3') [3] Эндонуклеазы рестрикции данного штамма термостабильны.

Недостатками данного штамма является то, что им продуцируются две рестриктазы. Это затрудняет получение чистого фермента без интерферирующей активности. Данные по продуктивности штамма и активности ферментов не опубликованы.

Цель изобретения получение штамма, продуцирующего единственную и термостабильную рестриктазу, узнающую и расщепляющую нуклеотидную последовательность 5'-CC(A/T)GG-3', с высоким выходом и активностью фермента.

Поставленная цель достигается выявлением и использованием штамма Bacillus stearothermophilus 38 продуцента сайт-специфической рестриктазы Bst38 I.

Предлагаемый штамм выделен из термальных источников в результате поиска продуцентов рестриктаз.

Полученный штамм Bacillus stearo-thermophilus депонирован в ВКПМ ВНИИ генетика под регистрационным номером В-5465, а продуцируемая им рестриктаза названа Bst38 I согласно общепринятой номенклатуре.

Штамм Bacillus stearothermophilus 38 характеризуется следующими признаками: Морфологические признаки.

Клетки палочковидные, прямые, 0,5 0,8 х 2 12 мкл, подвижные. Образуют эндоспоры овальной формы, терминально расположенные, вздутые относительно размеров вегетативной клетки. Окраска по Граму грамположительны.

Культуральные признаки.

Штамм нетребователен к факторам роста, хорошо растет на обычных питательных средах (СПА, МПА, МПБ). На агаризованных средах образует мелкие, круглые, непигментированные колонии, блестящие, с ровным краем.

Оптимальная температура роста 65^оС, рН 7,0-7,2.

Культуру поддерживают пересевом на плотных средах, хранят в растворе глицерина при -70^оС или в лиофильно-высушенном состоянии.

Физиологические признаки.

Не восстанавливает нитраты, отрицателен по лецитиназе в реакции с метиловым красным и Фогес-Проскауера; не гидролизует крахмал, казеин, желатин, эскулин; не использует малонат, цитрат, не растет при концентрации NaCl до 5% 0,001% лизоцима; энергично образует кислоту из глюкозы, очень слабо из арабинозы, ксилозы и маннита; не дезаминирует фенилаланин, не выделяет индол и сероводород.

Штамм высокочувствителен к антибиотикам: пенициллину, сульфатиозолу, ампициллину, гентамицину, менее чувствителен к тетрациклину, мономицину, неомицину, олеандомицину, левомицетину; устойчив к стрептомицину.

Для культивирования Bacillus stearothermophilus В-5465 применяют среду следующего состава, г/л: пептон 10, дрожжевой экстракт 5, глюкоза 5, вода дистиллированная остальное. Культивирование проводят при 65^оС и интенсивной аэрации до достижения фазы замедления роста.

Выход целевого фермента 100.000 ед/г сырой биомассы с удельной активностью 30.000 ед/мл.

Определяющими отличиями предлагаемого штамма от штамма-прототипа являются: наличие единственной термостабильной рестриктазы; высокая продуктивность штамма; высокая активность фермента.

Поскольку предлагаемый штамм получен впервые и для выделения рестриктазы, имеющей сайт узнавания 5'-CC(A/T)GG-3', никогда не использовался, можно сделать вывод о соответствии предлагаемого штамма критериям изобретения "новизна" и "существенные отличия".

На чертеже представлена электрофореграмма продуктов гидролиза ДНК фага ферментом Bst38 I (дор. 1), EcoR II и Bst38 I (дор. 2), EcoR II (дор. 3), Bst38 I (дор. 4), ДНК фага (контроль, дор. 5).

Как видно из чертежа, идентичность полос расщепления при параллельном и совместном гидролизе подтверждает их изошизометрию.

П р и м е р 1. Получение биомассы и выделение фермента.

Перед началом работы клетки штамма продуцента пересевают бактериологической петлей на агаризованную среду. Чашки Петри помещают в термостат на 65^оС. После 10-12-часовой инкубации подросшие клетки пересевают в колбы со свежей питательной средой, содержащей, г/л: пептон 10, дрожжевой экстракт (Difco) 5, глюкоза 5, вода дистиллированная остальное. Культивирование проводят при 65^оС с аэрацией 2 объема/мин, при перемешивании -150 об/мин, до фазы замедления роста. Клетки собирают центрифугированием при 1500 g и температуре 4^оС. Дезынтеграцию, выделение и очистку проводят по методике Bickle, Pirotta, Imber.

П р и м е р 2. Определение специфичности и активности фермента.

Специфичность фермента определяют по картине параллельного и совместного гидролиза субстратной ДНК. Идентичность картин гидролиза на 1-4 дорожках говорит о том, что эти ферменты узнают и расщепляют одинаковую последовательность нуклеотидов 5'-CC(A/T)GG-3'.

Выход фермента Bst38 I определяют по электрофоретической картине гидролиза ДНК фага лямбда. За единицу активности принимают минимальное количество фермента, необходимое для полного расщепления 1 мкг ДНК фага лямбда в течение 1 ч при температуре 65^оС. Выход фермента составляет 100.000 ед/г сырой биомассы, удельная активность 30.000 ед/мл.

Фермент хранится при -20^оС в глицерине.

Таким образом, полученный штамм, обладает следующими преимуществами по сравнению с известным: наличие единственной термостабильной рестриктазы; высокая продуктивность штамма;
высокая активность фермента.

Поскольку рестриктаза Bst38 I имеет сайт узнавания 5'-CC(A/T)GG-3', идентичный сайту узнавания рестриктазы BstG II, она может заменить прототип во всех генно-инженерных работах.

Формула изобретения

Штамм бактерий Bacillus stearothermophilus ВКПМ В-5465 продуцент эндонуклеазы рестрикции, способной узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5'-СС(А/Т) GG 3'.

РИСУНКИ

Рисунок 1