Способ определения антител к н @ v - 1

 

Использование: иммунология, диагностика СПИДа. Сущность изобретения: предлагаются синтетические пептмды, соответствующие областям иммунологически реактивных белков HJV-1, используемые при дигностике HJV-1-инфекции. 7 табл., 3 ил.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ (21) 4355648/13 (22) 25.03,88 (46) 15.03.93. Бюл. ¹ 10 (31) 8701294,4; 051726 (32) 27.03.87; 18.05.87 (33) SE; US (71) Синтелло АБ, SE (72) Андерс Валне, Бо Свеннерхолм, Ларс

Рюмо, Стиг Йеанссон и Петер Хорал (SE) (56) Schorr et al, N. Елдой,.). Med 1985 313;

385.

Popovic et al„Science, 1984, 224, 497500.

Kuhnl et a1., Lancef I, 1985, 1222 — 1223.

ОаПо et а!., Science, 1984, 224; 503, АПап ef а!., Science, 1985 — 228; 1091—

1094, Wang et.al. Proc, Nate. Acad. Scl 1986, 83, 6159 — 6163.

Патент США ¹ 4629783, кл. 530-324.

1986.

Изобретение относится к синтетическим пептидным антигенам, последовательности которых соответствуют. областям HJV — 1 белков, и к их применению в качестве диагностических реагентов для определения наличия антител к HJV—

1. Петиды также могут быть использованы в качестве иммуногенов в композициях для стимуляции продуцирования антител против HJV — 1.

H J V — 1 (человеческий вирус иммунодефицита-1) является названием данным группе высоко родственных вирусов, которые были идентифицированы как первичный этиологический агент для синдрома приобретенного иммунодефицита (AIOS) у людей

„„. Ж„„18О2871 АЗ (я)з G 01 N 33/53, А 61 К 39/12 (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К

Н)Ч-1 (57) Использование: иммунология, диагностика СПИДа. Сущность изобретения; предлагаются синтетические пептиды, соответствующие областям иммунологически реактивных белков HJV-1, используемые при дигностике HJV-1-инфекции. 7 табл., 3 ил. (СПИДа). HJV — 1, который также известен как HTLY — Ill, LAV и AKV, является главной проблемой мирового здравоохранения, С тех пор как HJV — 1 был впервые идентифицирован как этиологический агент СПИДа, значительный прогресс был достигнут в исследованиях вируса как такового и механизмов, с помощью которых вирус вызывает заболевание, и в разработке диагностических тестов для определения наличия вируса или инфекции, Методы определения заражения вирусом HJV — 1 в общем заключается в измерении наличия вируса путем обнаружения и количественного определения антител к

HJV — 1 — антигенам в крови, сыворотке и

1802871 веществах, вырабатываемых из крови, Та. кие методы используют с целью диагностики AIDS (СПИДа) и ARC (AIDS родственного комплекса) и для скрининга крови и продуктов из крови на предшествующее воздействие Н3Ч вЂ” 1.

Диагностику HJV — 1 инфекций и скринирование крови на наличие HJV-1 обычно осуществляют с помощью методик иммуноферментного анализа (Е LISA), чтобы определить наличие антител к иммуногенным компонентам HJV — 1 в испытуемом образце.

Другие методы включают использование блоттинговых методик Вестерна для Определения HJV — 1 специфических антител в испытуемых образцах. В общем может быть применен почти любой известный иммуноанализ, такой как радиоиммуноаналиэ, при использовании специфических реагентов для детектирования HJV — 1 и антител к нему.

Источником антигенов в первой генерации этих анализов обычно являлись антигенные белки, полученные из HJV — 1, продуцированного линиями человеческих хелперных Т-лимфобластоидных клеток, таких как Н9. Хотя зти первые генерации тестов ELISA íà HJV — 1 являлись достаточно чувствительными и специфическими, использование этих антигенов, полученных из живых вирусных препаратов, вызывает серьезные существенные трудности.

Продуцирование самого.HJV — 1 в непрерывных клеточных линиях может быть осуществлено с высокой степенью (РЗ компонент) в лабораториях из-за опасности для исследователей подвергнуться вредному воздействию вируса. Кроме-того. имеются четкие ложные отрицательные и ложные положительные результаты, которые были. получены в тестах ELISA с использованием целых антигенов вируса.

Блот-анализ Вестерна с использовани; ем цельных вирусных антигенов обеспечивает более высокую специфичность, но он более трудоемок и требует больших затрат времени, чем ЕО$А тесты. Кроме того, так как Н9 и другие HJV — 1 продуцирующие клетки являются линиями человеческих клеток, если они не подвергнуты дорогостоящей очистке, они могут загрязнЕны обычными клеточными антигенами, такими как HLA антигены, которые могут вызвать ложную положительную реакцию в тесте

ELISA.

Дорогостоящая очистка вирусных антигенов из клеточных линий также может предположительно разрушать иммуногенность иммунологически важных белков или, другими словами, дезактивировать антигены, s результате чего продуцируются реагенты, которые приводят к ложным отрицательным реакциям, Дополнительно, ложные отрицательные реакции с использованием антигенов, полученных из интактных вирусных препаратов, могут встречаться из-эа стерических затруднений, из-за которых антитела к вирусным антиге10 на не могут взаимодействовать со своим специфическим антигеном, потому что реакция заблокирована наличием других вирусных антигенов и антител в реакционной смеси.

Во второй генерации тестов ELISA для

Как показано на фиг.1, HJV — 1 является

25 относительно сложным ретровирусом. содержащим по крайней мере семь генов. Вирусные структуральные гены, обозначенные

gag, pol u env соответственно, кодируют

30 белки вирусного ядра, обратную транскриптазу и вирусные гликопротеины вирусной обОлочки. Другие гены, показанные на. фиг.1, являются вспомогательными генами, включенными в репликацию вируса Гены

gag и епч кодируют полипротеины, синтезированные из каждого из этих генов, являются пост-трансляционно расщепляемыми на несколько малых протеинов. Предыдущие исследования показали, что белки, кодированные gag и особенно env- областями HJV

- 1 — генома, являются иммунологически важными, так как антитела к продуктам gag и env генов найдены в сыворотке AIDS u

ARC пациентов.

env — ген кодирует гликопротеин (g

p160) с кажущейся молекулярной массой (Mr) около 160 000 дальтон, который является пост синтетически расщепляемым на два гликопротеина, g р 120 и gp 41 с молекуляр45 ной массой 120 000 и 41 000 соответственно.

Гликопротеин gp 120 является по-видимому наружным белком вирусной оболочки, тогда как "gp 41 по-видимому является трансмембранным белком. И gp 120 и gp 41 являются

50 иммуногенными с. антителами к обоим белкам, которые легко определяются в сыворотке больных AIDS u ARC.

Поскольку антитела к gp 120 и gp 160 в сыворотке больных AIDS и ARC, а также асимптоматических индивидуумов, зара55 определения HJV — 1 инфекции применяют иммунологически важные вирусные белки, которые могут быть продуцированы клонирующими участками HJV-1 генома в бакте20 рии. Вирусный этиологический агент AIDS (т.е. вирусы, ранее называемые HTLY-lll, LAV и ARV) из.различных источников был изолирован, клонирован и была определена нуклеотидная последовательность.

1802871

10

40 gp160/gp 41 преимуществами в отношении продуциро- пр сания специфических антител н реактиано- ни женных вирусом, являются нейтрализующими, т.е, ингибируют связывание вируса, gp 120, gp 160 или их участки являются кандидатами.для субединицы вакцины. Трансмембранный гликопротеин gp 41 является

HJV — 1 антигеном, более последовательно распознаваемым антителами в сыворотке больных AIDS и ARC(5). Крометого, антитела в сыворотке больного также распознают эпитопы белков ядра вируса, кодируемых

gag — геном, Иммунологически важные НЛЧ- 1 антигены для применения в диагностике и как потенциальные композиции вакцины были приготовлены путем клонирования участков

HJV — 1 генома в различных экспрессирующие системы, такие как бактерии, дрожжи или часс1п!а, HJV — 1 антигены, продуциро- ванные по методикам рекомбинантной

ДНК, однако, должны еще пройти дорогостоящую очистку, чтобы избежать ложных положительных реакций в ELISA из-за реактивности любого антитела к антигенам системы экспрессии, которые могут загрязнять препарат HJV — 1 антигена. Также денатурация HJV — 1 антигенов во время очистки может разрушить важную антигенную активность.

Белок антигенов содержит ряд эпитопов или антигенных детерминант, которые являются областями в белках, которые содержат сайты связывания для специфических антител. В общем белковые антигены срдержат 5-10 эпитопов, каждый из которых содержит последовательность из 6 — 8 аминокислот. Эпитопы могут быть или непрерывными, в которых 6-8 аминокислот имеются в последовательности, или периодическими, в которых аминокислоты, которые образуют эпитоп, связаны вместе трехмерной укладкой белков. Хотя эпитоп состоиттолько из относительно небольшого числа аминокислот, их реактивность с антителом находится под влиянием аминокислот в белке, который окружают эпитоп.

Исследования, направленные на картирование антигенных сайтов или эпитопов белков, были выполнены с использованием синтетических пептидов, соответствующих различным областям интересующих белков.

Помимо их полезности в исследованиях для картирования эпитопов синтетические пептиды, если они охватывают основные антигенные детерминанты белка, обладают потенциалом в качестве вакцин и диагностических агентов. Синтетические пептидные антигены обладают некоторыми сти. Последовательность синтезированного пентида может быть выбрана среди аминокислотных последовательностей, которые фактически определены при аминокислотном секвенсировании белка, или выводятся из последовательности ДНК, кодирующей белок. Использование специфических синтетических пептидов устраняет необходимость в использовании белка полной длины при продуцировании или для анализа специфических антител. Кроме того, методика синтеза пептидов в твердой фазе позволяет получать химически практически неограниченные количества интересующего пептида. Доступность автоматизированных синтезаторов пептидов является дополнительным преимуществом таких методик.

B некоторых публикациях представлены данные, показывающие иммунологическую реактивность выбранных синтетических пептидов, соответствующих антигенным белкам HJV-1. В одном исследовании был синтезирован пептид, имеющий аминокислотную последовательность

Tyr-A s p-Arg-Р ro-G lu-6 lu-6 Iy- I le-G I u-G I uG ly-G lu-Arg-Asр-Агр-Asр-Arg -Ser-Gly-Cys, которая соответствует аминокислотым остаткам 735 — 752 HJV — 1. Этот пептид, который является частью gp 41, использовали

30 для иммунизации кроликов в попытке вызвать нейтрализующий антитела ответ в

НЗЧ вЂ” 1.

Кроме того, несколько сывороток от больных AIDS, про которых было известно, 35 что они содержат анти-gp 41 антитела, были мало реактивными с этим пептидом; это указывает, что этот пептид содержит по крайней мере один эпитоп, распознаваемый до некоторой степени антителами к нативному

Недавно вышедшая работа относится к обеспечению синтетических пептидов для диагностики AIDS в дополнение к разработке композиций вакцины. В одном исследовании был синтезирован пептид.из 21 аминокислоты, названный SM284, с аминокислотной последовательностью Arg-ИеLeu-Ala-ЧаИо-Arg Tyr-1.eu-Lys-Азр-Glu-Le

u-Leu-Gly-Ие-Gly-Cys-Ser.

Этот пептид„который соответствует аминокислотам 586 — 606 в gp 160 и содержит антигеннь1й сегмент gp 41, является реактивным с HJV — 1 положительной сывороткой от больных AIDS/ARC при анализе методами ELISA и блоттиг-анализе Вестерна. SM284 пептид благоприятно выдерживает сравнение с протеинами, оисходящим из HJV- 1, при детектироваи HJV — 1 антител по методу ELISA.

1802871 нований 7516-7593 HIV — 1 генома. Пептид

V (39) реагирует с 23/24 (95,8 ) образцами сыворотки от больных с достоверной HJV

1 инфекцией.

Б соответствии с настоящим изобретением предлагаются новые синтетические пептиды, соответствующие антигенным

HJV — 1 белкам, которые являются полезными и превышают по селективности диагно; стические методы дпя детектирования

НЛЧ вЂ” 1 инфекций.

Найдены новые синтетические пептидные антигены, соответствующие гликопротеину gp 41, кодированному HJV — 1 env геном.

Эти пептиды используются дпя диагностики AIDS у подозрительных индивидуумов и в методах для скрининга на воздействие HJV — 1 крови и происходящих из крови продуктов с высокой степенью надежности и очень незначительным количеством ложных результатов.

Пептиды могут быть использованы в методах определения антител к HJV — 1 в обрээцэх. Мегоды включают контактирование

50. Например, в методе ELISA с использо. ванием SM284 детектируют антитела в образцах сыворотки у 96,5 j больных

AIDS/ARC и 34,6 j здоровых асимптоматических с высоким риском индивидуумов. Не 5 имелось ложных положительных в 387 сыворотках от контрольных индивидуумов.

Серологический и химический анализы

SM284 пептида и родственных пептидов показали, что некоторые аминокислоты по-ви- 10 димому являются более важными, чем другие при взаимодействии антителоантиген пептида. . Делеция остатков Arg-1, Ие-2- и Lys-10 иэ пептида значительно снижает или унич- 15 . тожает серологическую реактивность. Делеция ТГУ-GIy-Cys-Ser остатков у карбоксильного конца. пептида, с другой .стороны, приводит в результате к умеренной потере серопогической активности, ука- 20 эывая,. что аминоконцевая часть пептида является по-видимому более важной, чем карбоксипьная концевая часть для иммунологической реактивности.

Предлагается несколько иммунологиче- 25 ски реактивных синтетических пептидов, соответствующих областям HJV — 1 белков .для детектирования AIDS u AIDS — родственной болезни. Особенно интересным является пептид V . (39), . имеющий 30 последовательность Агд-Ие-Leu AIa-.Val-GluArg- Tyr-Le u-Lys-Asp-G t u-6 lu-Leu-le u-G Iy-II е-Trp-Gly-Cys-Ser-GIy-Lys-Leu-Ие-Cys Х, где

Х является ОН или NHg, который соответствует участку gp 41, кодируемому парами ос- 35 образца с пептидными антигенами в условиях, которые позволяют образоваться иммунологичесокму комплексу между пептидом и любым HJV — 1 специфическим антителом в образце. Измерение образования комплекса с помощью любого детектирующего средства указывает на наличие или отсутствие антител к HJV. 1 в образце.

Также могут быть использованы новые пептиды в качестве иммуногенов в композициях вакцины для иммунизации против HJV — 1 инфекции ипи для продуцировэния у животн ых H J Ч вЂ” 1 специфических антител против HJV — 1 антигенов.

На фиг.1 схематически представлены гены HJV — 1; на фиг.2 — ген gp 41 HJV-1, изображенный в виде частично перекрывающих пептидов, синтезированных в соответствии с изобретением, и сравнение известных пептидов, соответствующих gp

41, на фиг.3 — гистограмма, показывающая величины EL ISA, полученные с использованием gP4IA5 в качестве антигенэ.

Изобретение посвящено ряду пептидов длиной 15 — 27 аминокислот, соответствующих областям белкового продукта целого

HJV — 1 gag гена и gp 41 HJV — 1, которые были синтезированы и испытаны на иммунореактивность к HJV — 1 положительным образцам сыворотки, полученным из Соединенных Штатов, Великобритании, Израиля, Африки и Швеции. Новые пептиды являются полезными в тестах на диагностику HJV - 1 инфекции или на предшествующее воздействие вируса и в качестве иммуногенов в композициях, чтобы вызвать продуцирование у животных и людей антител против

H J V - 1. Пептиды, соответствующие gag. белкам и в частности gp 41 были собраны и синтезированы, потому что эти HJV - 1 белки показывают меньшую вариацию от штам- ма к штамму характеристик, чем другие иммунологически важные HJV — 1 антигенные белки, такие как gp 120. Пептиды, охватывэемые изобретением, включают олигопептиды, имеющие аминокислотные последовательности, содержащие такие последовательности, которые содержат непрерывные (линейные) эпитопы, реактивные с HJV — 1 специфическими антителами.

Следовательно, изобретение охватывает группу иммунологически реактивных пептидов и функционально эквивалентных вариантов их, кото рые не ухудшают в значительной мере антигенные свойства пептида, соответствующего gp 41, кодируемого епч геном HJV — 1.

Области gp 41, соответствующие каждому пептиду, детально описанному ниже, по1802871

10 казаны на фиг.2, Все пептиды синтезирован ы по известным методикам синтеза пептидов на твердой фазе. Синтез также позволяет, чтобы одна или две аминокислоты, несоответствующие первоначальной последовательности белка, были добавлены к

NHz — или C00H — концу пептидов. Такие наружные аминокислоты являются полезными для сочетания пептидов друг с другом, для содержания с белковым носителем или с подложкой. Аминокислоты, которые являются полезными для этих целей, включают тирозин, лизин, глютаминовую кислоту, аспаргиновую кислоту, цистеин и их производные. Могут быт ь использованы дополнительные методики модификации белков, например, NH2 — ацетилирование или СООН вЂ” концевое амидирование, чтобы обеспечить дополнительное средство для сочетания пептидов с другим белком или молекулой пептида или подложкой, Новые пептиды, соответствующие gp

41, представлены ниже:

g p41A5

Х-Asp-Gln-Gin-Leu-Leu-Gly-! !е-Trp-G lyCys-Ser-G ly-Lys-Leu-! !е-Суз-Thr-Thr-A! а-Va 1

-Pro-Trp-Азп-1-2, где Х является или Н концевой амино NHz — группы пептида, или дополнительной аминокислотой„связанной с аминоконцевой КН2 — группой пептида, дополнительную аминокислоту выбирают для облегчения сочетания пептида с носителем белка; J — отсутствует или является Cys; а.Z является ОН или ИН2.

Пептид gp41A5, который соответствует аминокислотам 596 — 618, кодируемым парами оснований (по) 7563 по 7632 HJV — 1 генома, соответствующими епч гену является особенно предпочтительным вариантом настоящего изобретения. Пептид gp41A5 в котором X является Н2, J является Суз и Z является ОН, является особенно предпочтительным.

gp41CT4

Пептид gp41CT4, который соответствует области gp41 белка, кодируемого по примерно от 8173 до 8238 H JV-1 генома, имеет формулу: Х-Ala-1 ец-Lys-Tyr-Trp-Trp-AsnLeu-Leu-Glu Tyr-Trp-Ser-Gin-Glu-Leu-Lys-А

sn-Ser-А1а-Val-Ser-Я, где Х, J u Z имеют указанные ранее значения.

9р41СТЗ

Пептид цр41СТЗМ, который соответствует области gP41, кодируемой по от примерно 8220 до 8280 HJV — 1, имеет формулу:

Х-Lys-Asn-Ser-Ala-Чаl-Ser-Leu-Leu-Asn-А!а

-Thr-Аlэ-Пе-Ala-Va I-Ala-Glu-Gly-Thr-As p-J-Z, где Х, J u Z имеют указанные ранее значения, gp4181

Пептид 9р4181, который соответствует области gp41, кодируемой от пр..мерно по

7614 до 7686 IJV — 1 генома епч гена, имеет формулу: Х-Thr-А!а-Ча1-Pro-Тгр-Ass-Ala-SerTrp-Ser-Asn-Lys-Ser-Leu-6tu-6lu-!! е-Тгр As

n Asn-Мет-Trp-Trp-МеМ-Z, где Х, J u Z имеют указанные ранее значения.

gp4183

Пептид цр4183, который соответствует области gP 41, кодируемой примерно по

7705 до 7773 HJV — 1 генома, имеет формулу:

Х-! Iе-Asn Tyr-Thr-Ser-Leu-!!е-His-Ser-Leu-If е-G! u-61о-Яег-G ln-As и-6 In-61п-G In-Lys-Аз и

-GIu-J-Z, где X, и Z имеют указанные ранее значения.

Кроме того, изобретение охватывает некоторые иммунологически реактивные пеп-. тиды и их функциональные варианты, соответствующие областям белковых продуктов, кодируемых gag геном Н1Ч вЂ” 1 (фиг.1). Эти новые пептиды представлены ниже:

6AG 2

Пептид GAG 2, который соответствует

25 области gag генного продукта, кодируемого по примерно 779 до 840 gag гена Н1Ч вЂ” 1, имеет формулу: У.-Рго-Arg Thr-Lev-Asn-AfaTrp-Ча1-Ча Glu-61о-Lys-Ala-Phe-Ser-Pro-Glu

-Ча1-.1-Z, где Х, J u Z имеют указанные ранее

30 значения

GAG 3

Пептид GAG 3, который соответствует области gag генного белкового продукта, кодируемого по примерно 810 до 870 gag гена, 35 имеет формулу: Х-Val-Glu-Gtu-Lys-А!а-PheSer-Pro-G lu-Ча 1-! 1е- Pro-Мет.-P he-Ser-AtaLeu-Ser-Glu-6ly-)-Z, где Х, J u Z имеют указанные ранее значения.

6А6 14

40 Пептид GAG 14, который соответствует области gag генного продукта, кодируемого по примерно 1368 до 1430 HJV — 1 gag гена, имеет формулу: Х-6 1 v-Мет-Met-Thr-Ala-СузG1 и-G I y-Va t-6 ly-G ly-Р го-C ly-His-Lys-Аlа-Arg

Р17-D

Пептид Р17-D, который соответствует области gag генного белкового продукта, кодируемой по примерно 495 до 560 HJV — 1 оао гена, имеет формулу: У.-Ser-G tu-6ly-CysArg-61n-! 1е-Leu-6ly-G t n-Leu-G t n-Pro-Ser-Leu

-G1n-Thr-Gly-Ser-Gin-Leu-J-Z, где Х, J u Z имеют указанные ранее значения.

Р17-F

Пеприд Р17-F, который соответствует

55 области оао генного белкового продукта, кодируемой по примерно 588 до 647 HJV — 1 оао гена, имеет формулу: Х-Leu Tyr-Cys-ValН1з-Gin-Arg-lie-Gin-Ие-Lys-Asn-ТЬ-Lys-6lu

45 -Val-Leu-Ata-Glu-1-Z, .-де Х, J u Z имеют указанные ранее значения.

1802871

-AIa-Leu-Asp-Lys-Ile-J-Z, где Х, J u Z имеют указанные ранее значения.

Пептиды могут быть использованы в способахдетектирования антител к HJV — 1 или ассоциированным НЗч — 1 антигенам.

Предпочтительно методы, которые используют пептиды для детектирования наличия

HJV — 1 специфических антител в образце, включают контактирование образца с по крайней мере, одним из пептидов в условиях, которые допускают образование имму-. нологического комплекса между пептидным антигеном и любыми антителами к HJV — 1, которые могут присутствовать в образце.

Образование иммунологического комплекса, если оно происходит, указывает на наличие антител к HJV — 1 в образце, затем оно детектируется и измеряется подходящими средствами.

Такие методы включают, среди прочих, иммуноанализ гемогенного и гетерогенного связывания, такой как радиоиммуноанализ (РИА), ELISA, и блот-анализ Вестерна. Кроме того, протоколы анализов с использованием новых пептидов позволяют провести исследование конкурентного и неконкурентного связывания.

Пептиды могут быть мечеными (ненерирующими сигнал) или немеченными в зависимости от типа используемого анализа.

Метки, которые могут быть соединены с пептидом, хорошо известны на данном уровне техники и включают, среди прочих, ферменты, радионуклиды, флюорогенные и хромогенные субстраты, кофаткоры, биотин/авидин, коллоидное золото и магнитные частицы. Модификация новых пептидов позволяет сочетать их известными методами с носителями белков или пептидов или с известными подложками. например, полистирольными или поливинилхлоридными плашками для микротирования, стеклянными трубками или стеклянными шариками и хроматографическими носителями, таким как бумага, целлюлоза и производные целлюлозы, и оксид кремния, Предпочтительной аналитической методикой, особенно для широко масштабного клинического скрининга сыворотки и крови и происходящих иэ крови продуктов больных являются ELISA и блот-анализ Вестерна, особенно предпочтительной является методика ELISA, ELISA тесты, применяющие описанные выше пептиды, основаны обычно на тестах с использованием HJV — 1 белков или их частей, происходящих иэ человеческих клеток или полученных flo методике рекомбинатной ДНК, в качестве антигенов.. При использовании в качестве реагентов в этих анализах пептиды обычно связывают с внешней поверхностью стенок микротитратора. Пептиды могут быть непосредственно связаны со стенкой микротитратора. Однако было обнаружено, что

5 максимальное связывание пептидов со стенками может быть осуществлено при предварительной обработке стенок полилизином перед добавлением пептидов, Дополнительно новые пептиды могут

10 быть ковалентно присоединены с помощью известных средств к белковому носителю, такому как БСА, полученный в результате конъюгат используют для покрытия стенок.

Обычно пептиды используют в концентра15 ции между 10 и 100 мкг/мл для покрытия, хотя некоторые пептиды для успешного анализа имеют концентрации порядка 500 мкг/мл.

Образцы затем наносят на покрытые

20 пептидом стенки, где образуется иммунологический комплекс, если в образце имеются антитела к HJV — 1. Могут быть добавлены генерирующие сигнал средства, чтобы способствовать определению образования

25 комплекса. Детектируемый сигнал продуцируется. если в образце имеются специфические к HJV — 1 антитела.

Изобретение далее иллюстрируется следующими конкретными примерами, ко30 торые ни в коей мере не должны рассматриваться как ограничивающие область изббретения.

Пример 1; Для синтеза всех пептидов используют Эпплайд Биосистем пептидсин35 тезизер Модель 430 А, В каждом синтезе используют и-метилбензилгидриламинную твердую фазу — подложку из смолы "Пептидс Интернейшнл ЛуисвиллЬ, КИ). Пептиды были синтезированы в соотвествии с

40 Инструкцией для пользователя для Пептид

Синтезизер Модель 430 А, Эпплайд Биоси стемс, 1986 r, Все аминокислоты для использования в синтезе, содержащие трет.-бутилкарбо45 нильную группу (т-Вос), защищающую а—

NHz- группу, были получены из Новабиохем

АГ, Швейцария, Аминокислоты с реактивными боковыми группами, содержат дополнительные защищающие группы для

50 предотвращения нежелательных и вредных реакций в боковых цепях.

Индивидуальные защищенные аминокислоты, использованные для синтезе всех пептидов, приведены в таблице 1, находя55 щейся в приложении.

После завершения конкретного синтеза удаляют защищающие группы их синтезированного пептида и пептид отщепляют от смолы твердого носителя с помощью обработки безводной фтористоводородной кис

1802871 лотой (HF) при 0 С в сочетании с 10% анизола и 10% диметилсульфоксида в качестве очищающих агентов. Затем прибавляют 2%

Тиокрезола для цистеин-содержащих пептидов, отдувают током азота HF из образца, 5 удаление любого остаточного YF осуществляют путем вакуумирования образца при

0 С. Пептиды экстрагируют из смолы при обработке трифторуксусной кислотой (ТФУК), которую затем удаляют выпарива- 10 нием при комнатной температуре, После удаления ТФУК пептиды осаждают и промывают.безводным эфиром.

Перед использованием в конкретном анализе пептиды могут быть дополнительно 45 очищены, при желании, с помощью высоко, эффективной жидкостной хроматографии с обратимой фазой (HPLC). Особенно пригодной колонкой для такой очистки является колонка с обратимой фазой Видек С-18, 50 для элюирования пептидов используют гра- диент вода (ТФУК) — ацетонитрил (ТФУК), Пример 2. Синтезируют пептид

gp41A5, имеющий аминокислотную последовательность Asn-Gin-Gln-Leu-Leu-Gly-Ие- 55

Trp-Gly-Cys-Ser-Gly-l уз-Leu-Ие-Cys-Thr-Thr

-Ala-VaI-Pro Trp-Axn-Суз-ОН, по методике примера 1 и используют его в ELISA для измерения его иммунологической реактивности.

Табл ица 1 15

Аминокислоты, использованные для синтеза пептидов

Вос-Ala-ÎH

В ос-Arg(Tos)-OH

Вос-Asn-OH

Вас-As р-(О Bzl)-О Н

Вос-Суз(рМеОВ !)-0

Вос-Glu(08zl)-ÎH

Boc GIn-ОН

10 Вос-Gly-OH 25

Boc- lis(Tos)-ОН

Вос-lie-OH 1/2 Н О

Вос-Leu-ОН Н О

Вос-1 уз(2-CI-Z)-0H (сгуз .)

15 Вос-Met-OH 30

Вос-Phe-OH

В ос-Рго-OH

Вос-Ser(8zl)-OH D CHA

Вос Thr(BZI)-OH

20 Вос-Trp(Forrnyl)-ОН 35

В ос-Туг(2-В r-z}-0H

Вос-Val-ОН

Tos = тоэил или и-толуолсульфоновая кислота

oBzl = бензилокси . . pMeoBzl = n-метилбензилокси 40

2-CI-к = карбобензоксихлорид

2-Br-z= карбобензоксибромид

На плашки для микротитрования наносят полилизин в концентрации 1 мг/мл и инкубируют 30 мин. Затем полилизин обрасывают и на стенки плашки наносят пептид

gp41A5 в концентрации от 10 до 100 мкг/мл для покрытия. После инкубирования пептида на стенках в течение периода времени, достаточного для связывания со стенкой, удаляют раствор пептида и прибавляют в течение 15 минут раствор глутарового альдегида, который стабилизирует присоединение пептида к стенкам. Затем удаляют раствор глутарового альдегида, стенки промывают буфером и прибавляют смесь глицина и бычьего сывороточного альбумина (БСА), который служитдля блокирования несвязанных сайтов на стенках и сводит к минимуму нееспецифическое связывание антител во время самого теста ЕАЗА. После стадии окончательной промывки плашки готовы к использованию. Покрытые пептидом плашки для микротитрования могуг храниться несколько месяцев без какого-либо снижения антигенной активности пептида

gp41A5, покрывающего стенки.

Используют обычный вариант известных методов ELISA с плашками для микротитравания, приготовленными, как описано выше. Образцы сыворотки от индивидуумов; которые были разбавлены 1:50 в Р85 (фосфатный буферный солевой раствор), содержащем 0,05% полиоксиэтиленсорбитан монолаурата (Твин 20), прибавляют 1% БСА на каждую стенку и инкубируют 30 мин при

37 С во влажной атмосфере. Разбавленные образцы сыворотки затем удаляют из плашек и три раза промывают стенки PBS, содержаа щим 0,05% Твин 20. Затем прибавляют конъюгированное анти-человеческий Ig антитело на стенки и инкубируют

30 мин. Конъюгированные антитела были получены у коз или кроликов, они являются специфическими для человеческого IgC, IgM, легких иммуноглобулиновых цепей и их сочетаний, Предпочтительно в ELISA используют коньюгированную щелочную фосфотазу с анти-человеческим IgC (от

Дакопаттс); разбавленную 1:500 для использования в PBS, содержащем 0,05% Твин 20 и 1% БСА. Затем конъюгат инкубируют в течение достаточного периода времени, чтобы прошла реакция со связанными человеческими антителами, плашки три раза промывают, как указано выше. Для того, чтобы детектировать антитела к HJV — 1 в человеческой сыворотке, которая реагирует с пептидом gp41A5, использованным в качестве антигена (т.е. положительная реакция), прибавляют хромогенный субстрат субстрата щелочной фосфатазы (Сигма, кат, ЬЬ 104, 15

1802871

16 таблетки), растворяют в натрийкарбонат. ном (Mg CI буфере и доводят концентрацию до 1 мкл/Mn, которая расщепляется ферментом, воздействующим на античеловеческий

Ig с получением окрашенного продукта. После инкубации примерно в течение 40 мин при комнатной температуре положительные реакции указывают на наличие антител в образце, реактивных к антигену. Желтую до оранжевой до красно-коричневой окраску на каждой стенке, указывающую íà положительную реакцию, регистрируют на спектрофотометре при 405 нм для количественного определения реакции. Спектрофотометрические показатели регулируют для корректировки основных реакций.

На фиг.3 представлена гистограмма, показывающая количества антител, полученные иэ четы рех отдельных ELISA определений с использованием р. 41А5 в качестве антигена. 101 истинной положительная (по блот-анализу Вестерна) сыворотка от больных AIDS u ARC и 179 истинно отрицательных сывороток вводят в реакцию в системе ELISA с gp41A5; Среднее отклонение для положительных реакций было определено равным О.Д.405 - 0,376. На фиг.3 показано, что gp41A5 дает положительную реакцию со 100 (101/101) истинно положительных сывороток и 0% (О/179) с истинно отрицательными сыворотками.

Пример 3. Для сравнения с новыми пептидами был синтезирован известный пептид Ч (39) Козанда, как описано в примере 1, в соответствии с его аминокислотной последовательностью, опйсанной в:патенте

США hL 4629783. Относительная локализация этого пептида в gp41 показана на фиг.2, на котором приведена относительная лока. лизация последовательности gp41A5 и других пептидов, соответствующих gp41 HJV—

1. Козанд сообщил, что пептид V(39) реагирует с 23/24 (95,8%) достоверно положительными сыворотками (т.е. при одной ложной отрицательной реакции). Пептид был использован в ЕЫ$А, описанной в примере 2, с заменой на пептид V (39) пептида др41А5.

Пептид (V) (39) дает 221/233 (94,8 ) положительных реакций с известными HJV-1 положительными образцами сыворотки.

Было отмечено 12 ложных отрицательных реакций, как показано в таблице 2. Кроме того, пептид V (39) дал ложную положительную реакцию в одной из 102 (0,98о ) достоверно отрицательных сывороток. Образцы сывороток были удостоверены как положительные и отрицательные с помощью блотанализа Вестерна с HJV — 1 белками. Все ложные положительные и отрицательные

10 реакции были подвергнуты блот-анализом

Вестерна.

Кроме того из фиг.2 видно, что gp41A5 имеет частичное перекрывание в аминокислотной последовательности с пептидом SM

284 и пептидом(39) Козанда, Следовательно пептид др 41А5 содержит аминокислотную последовательность у карбоксил-концевого участка двух известных пептидов плюс дополнительную последовательность, соответствующую области gP41 с карбоксил-концевой стороны пептидов

$М284 и V(39), Как обсуждалось ранее, Вонг сссотр, рассматривал карбоксил-койцевой

15 участок пептида SM284 как иммунологически менее важный при сравнении с аминоконцевым участком пептида р M:284. В противоположность Вонгу с сотрудниками, однако, расширение замен gp41A5 к карбок20 сильному концу gP41 приводит в результате к пептиду, имеющему отличные антигенные свойства для детектирования AIDS — специфических антител в человеческой сыворотке. Этот пептид показывает как более

25 высокую степень реактивности, так и более высокую специфичность в EL!SA и в блотанализе Вестерна, чем у обоих пептидов V (39) и SM 284.

Таблица 2 показывает, что gp41A5 реа30 гирует со всеми 233 (100 ) достоверно положительными HJV — 1 сыворотками. Эти результаты были получены с теми же 233 сыворотками, испытанными против пептида

V (39), который дали 12 ложных отрицатель35 ных реакций. Среднее отклонение величин для положительной реакции в тестах ELISA составило О.Д.405 примерно 0,3, Любое значение ниже 0.3 рассматривается как отрицательная реакция. Легко видеть, что об40 разцы сывороток ММ 7, 19, 40, 44, 60, 101, 482, 511, 324, 375 и 393 четко показывают отсутствие реактивности с пептидом V(39), но высокую реактивность с g P41A5, Таблица находится в приложении.

45 В таблице 3 приведено дополнительное сравнение более высокой иммунологической реактивности gp41A5 по сравнению с пептидом V (39) Коэанда, Иэ 233 образцов сывороток, представленных в таблице 2, 38

50 были удостоверены как положительные по блат-анализу Вестерна. Эти положительные сыворотки плюс 8 подтвержденных отрицательных образцов сыворотки (по блот-анализу Вестерна) вводят в реакцию с

55 пептидами gp41A5 и V (39) в параллельных тестах ELISA с положительными реакциями, имеющими О.Д.405 примерно 0,3.

Кроме того, не-HIV — 1 антиген (отрицательный антиген) используют в качестве контроля. Легко видеть, что gp41AS не дает

1802871 ни ложных отрицательных ни ложных положительных реакций. Следовательно, неожиданно gp41A5 дает по методике ELISA результаты, которые являются четко на

100% точными. Диагностическая и скринирующая способности в анализах с использованием gp41A5 четко выше, чем у обычных используемых в анализе пептидов V (39) и SM284 или любого другого

НЬЧ вЂ” 1 антигена.

Пример 4. Пептид. AS-Тгоп с/а/ с пропущенным карбоксильным концевым участком gp31A5 фиг.2 также синтезируют по методике примера 1 и используют в тестах ELISA, как описано в примере 2, не заменив пептид gp41A5 íà AS-trunc/a/, для измерения антигенной активности. Из результатов ELISA, представленных в таблицах 4, легко видеть, что очевидно, что карбоксильная концевая часть gp41A5 требуется для высокой степени реактивности и специфичности этого пептида.

Пример 5. Синтезируют по методике примере 1 пептид gp41CT4, имеющий аминокислотную последовательность, представленную выше, и испытывают в анализе

EL1SA по методике примера 2 (заменив

gp41A5 на gp41CT4 против 105 HJV — 1 положительных, сывороток (все они реагировали с gp41A5). Наносят покрытие на плашки для микротирования по методике примера

2 при концентрации пептида между 10 и 100 мкг/мл, Как показано в таблице 5, этот пептид реагирует с 68/106 (64,8%) положительными сыворотками. Не наблюдалось ложных положительных реакций при испытании этого пептида против 28 достоверно отрицательных сывороток.

Пример 6. Синтезируют по методике примера 1 пептид gp41CT3, имеющий аминокислотную последовательность, представленную выше, и показывают им плашки

: для микротитрования по методике примера

2 (заменив gp41A5 на gp41CT3). Как показано в таблице 5, др41СТЗ реагирует с 38/80 (48,8%) образцами заведомо положительных сывороток в анализе ELISA, как описано в примерах 2 и 3. Пептид дает только одну ложную положительную реакцию при испытании против 20 заведомо отрицательных сывороток.

Пример 7. Покрывают плашки микротитратора пептидом др41В1, синтезированным по методике примера 1, с концентрацией 10-100 мкг/мл, покрытие проводят по поисанной выше методике и используют в анализе ELISA, как описано в примере 2 (заменив gp41A5 íà gp41B1).

Этот пептид реагирует с 45/95 (47,4 %) образцов достоверных HJV — 1 положитель10

25 в таблице 6

30 используют в анализе ELISA по методике

40 ответ при использовании Н!  — 1 антигенов.

50

55 ных сывороток (таблица 5). Не имелось ложных положительных сывороток (таблица 5), Не имелось ложных положительных реакций с двумя отрицательными сыворотками.

Пример 8. Покрывают пептидом др41ВЗ, синтезированным по методике примера 1, с концентрацией 10-100 мкг/мл плашки микротитратора, Он дает положительные реакции с 22/32 (68,8%) заведомо положительными HJV — 1 образцами сыворотки в анализе ELISA, как описано в примерах 2 и 3 (таблица 5). Не наблюдали ложных положительных реакций с двумя заведомо отрицательными сыворотками.

Пример9. Синтезируют ОАО 2 и GAG

3 и GAG 14пептиды по методике примера 1.

Наносят покрытие на плашки микротитратора из каждого пептида при концентрации

10-100 мкг/мл и используют в анализе

ELISA, как описано в примере 2, но изменив

gp41A5 íà GAG 2, GAG 3 или GAG 14 как антиген. Пептид ОАО 2 также анализируют против HJV — 1 положительных образцов сывороток. Результаты анализов приведены

Пример 10. Синтезируют пептиды

Р17-D и Р17-F по методике примера 1 и покрывают каждый пептидом при концентрации 500 мкг/мл плашки микротитратора, примера 2, но заменив gp41A5 на Р17-D u

Р17-F в качестве антигена. Эти пептиды также анализируют против HJV — 2 положительных образцов сывороток, Результаты представлены в таблице 7.

HJV — 2, родственных ретровирус, но не идентичный HJV — 1, недавно был выделен у больных AIDS из Западной Африки, который в анализе Ei!SA дает отрицательный

Из данных таблиц 6 и 7 можно видеть по данным примеров 9 и 10, что пептиды GAG

2, Р17-0 и Р17-F каждый содержит эпитопы, распознаваемые антителами как к HJV — 1, так и к HJV — 2..Следовательно, эти три пептида могут быть полезными для диагностики и композиций вакцин при обеих инфекциях H JV — 1 и H JV — 2.

Из приведенных выше результатов очевидно, что новые синтетические пептиды, описанные здесь, которые соответствуют областям иммунологически важных белков

НИ вЂ” 1, например gp41 и оао генным продуктам, обеспечивают более чувствительный и селективный анализ на наличие антител к HJV — 1.

Формула изобретения

Способ определения антител к HJV — 1 путем взаимодействия с антигеном в имму1802871

20

Иммунологическая реактивность, определенная ELI SA между HIV-1 антителами в 233 образцах достоверно положительных сывороток и синтетическими пелтидными антигенами, соответствуюцими областям gp41

Гыворотка, образец Р

,Антиген

v(39) р41А

2, U09

1,412

2, 222

2, 890

О, 43Ь

0,137

0,33b

0,836

0,U8g

13

17

1,527

2, 711

2,922

2,822

2, 010

2,Ь35

19

23

2,ЬОО

27

29

2, 029

2, 459

2, 00 нологической реакции, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью повышения точности, в качестве антигена используют один или более полипептидов формулы

Х-Asp-Glu-Glu-1.еМ еи41у-!!е-Тгр-Gly-Cy

s-Ser-Gly- 1.ys-Leu-lie-Cys-Thr-Thr-АlаVal-Рro-Trp-Аsn-Y-Z, Asp-GIп-6! и-LeuL e u -G l y- T r p-6 1 y- Cy s-Se r-G ly1 уs-1.еu-lie-Cys-Thr-Аlа-ЧаI-Pro-TrpAsn-Cys-Î Н, Х-Ala-Leu-Lys-Tyr-ТгрАзп-Leu-1.eu-6ln-Туг- Trp-Ser-GlnG l u-Le u- Ly s-А з п-S e r-Ala-Val-Ser- Y-Z, Х-Lys-Asn-Ser-Ala-Val-Ser-Leu-Leu-Asn-А

I а- Thr-,AI à-11 е-Al а-Ча I-Al à-G l u-G ly-ThrAsp-Y-Z, Х-Thr-Ala-Чаl-Pro-Trp-Asn-AlaS e r - Т r р - S e r - А s и - L y sSer-Leu-Glu-Glu-1 1е-Тгр-Asn-Asn-Met-Thr

-Trp-Met-Y-2, Х-lie-Asn-Ту -Thr-Ser-LeuIle-Hls-Ser-Leu-Ile- Glu-Glu-Ser-Glu-Asn-GlnG1n --6!u -1 у-s - А s n - G !u - Y - Z, Х- Р ro-Arg Thr-1.е и-А s и-А 1 а- Trp

- Ч а 1- L y s - Ч а 1- V a I - G r u - G I u - L y sАlа-P he-Ser-Pzî-Glu-Va l- Y-Z, X.Val-G lu-G ly-Lys-Ala-P he-Ser-P ro- G1ó - Чай lе- Pro-Met-Phe-Ser-Ala-Leu-SerGlu-6 ly-Y-Z, Х-61и-Met-Met-Thr-Ala-CysG I n- G1у- V a1- G1у-G l yP ro-G 1y-Н l s-Lys-Ala-Arg-Val-Leu-Ala-G lu

- Y-Z, X-S er-G lu-G ly-Cys-A rg-G ln-l le-LeuGly-6!и-Leu-Gln- Pro-Ser- eo-Gln-Thr-GlySer-Glu-6Меи-У-Z. и/или

Х-Leu-Tyr-Cys-Val-His-Gln-Arg-lie-Gl и-! !е-Lys- As p-Thr-Lys-Glu-Ala-Leu-As pLys-I le- Y-Z, где Х- или Н в аминоконцевой.йН -группе пептида, или аминокислота, связанная с аминоконцевой NHz-группой пептида, причем кислота выбрана для обеспечения связывания пептида с белковым носителем;

J- или Cys, или отсутствует, Z — или ОН, или NHz.

Приоритет по признакам

27.03.87 — пептид Asp-Gln-61п- ео-LeuGly-lie Tzp-Gly-Cys-Ser Gly-Lys-Leu-Ile-CysТЬ-Thr-Ala-Val-Pro Trp Asn-Cys-ÎH.

18.05.87 Все другие признаки формулы изобретения.

Т а б л и ц а 2

1 33Ь

О, 2U9

1, 70Ь

О, 48

О, 484

1, 443

О,U10

1,399

1,UU9

1802871

22

Продолжеиие табл.2

37

39

41

43

47

55

56

) 9

79

101

482

)30

134

)37

140

232

0,737

1, 244

0,938

1, 007

1, 028

1,3Ь2

О, 227

1, 282

0у 731

0, 522

1, 096

1, 456

0, Ü65

0,195

1, 532 0,7)2

1, 217

О, b02

1, 444

0,832

),)64

О, 219

0, 489

0,927

0,205

0,)20

О, 248

О, 346

1,256

1, 095

О, 952

),4b4

1, 877

2, 343

2, 871

2,7)4

2,859

2,378 у 5

1, 495

2, b92

2, 289

1,978

2,443

1,844

2, 79Ь

2, 636

2, 592

2, 809

2,579

2, 714

2, 423

2, 567

2, 511

2, 468

2,232

2, 72Ь

1, 399

1, 826

2,247

0,863

1,316

1, 036

1, 741

2, 425

2,413

2,364

2, 540

2,b54

24 ( (3

2,397

2,767

0,644

1,9ь8

243

272

273

274

276

277

278

279

283

286

15

30

1, 329

1,255

287

288

289

291

292

293

294

297

298

301

302

303

30ь

307

308

312

313

314

317

318

319

1802871

Продолжение табл.г

1,404

2, 037

1, 786

1,900—

1, 106

1,.203

0,555

1, 293

0,437

1, 017

О, 798

0,875

1,544

0,728

0,690

1, 096

О, 861

1,631

1,598

1,204

1,854 о, 796

1, 0Ü5

0, 733

1,375

1,745

1, 239

1,142

1, 291

1,100

0,456

0,ьЬ9

2,6ЬО

2,821

2,609

2, 745

2, 243

2,354

2, 579

2,570

1,977

2,108

1,845

2, 569

2, 572 2,561

2, 032

2,466

2,228

2, 696

2, 764

2, Ь36

2,63ь

2, 431

2, ü23

2,381

2, 686

2, ь9ь

2,383

2,687

2,553

2, 152

1,266

1,051

1,61ь

2,008

1802871

Продолжение табл 2

45

10

20

321

322

323

324

332

333

334

33b

337

341

357

358

359

ЗЬО

363

36е

368

371

372

373

374

377

378

379

381

383

384

386

387

388

1, 024

1, 493

1, 092

1, 292

О, 281

О, 725

О, Ь83

1,620 .

0,923

11309

1,258

1, 194

1, 290

1, 138

О, 738

О, 599

0,528

О, 711

1,390

О, 821

0,6Ь5

1,183

1,075

0,799

1,046

О, 280

1 065

1, 261

0,610

1,205

1, 321

0, 552

0,620

0,973

1, 687

0, b95

0,928

1, 941

2, 347 l, 850

2, 077

1,299

1,483

1,385

1,901

1 579

1 951

2,166

1,689

1,763

1,754

1, 733

1, 033

О, 840

1, 291

1,963

1,682

1,417

1, 585

1, 593

1, 711

1 650

0,957

1,480

1,644.

1,242

1,763

1,645

1, 146

1, 029

1, 618

1, Ь4Ь

1, 189

1, 396

1802871

Продолжение табл.2

2 (30

40

50

389

391

392

393

394

396

398

401

403

406

407

408

411

412

"13

414

416

417

419

422

426

427

428

429

431

432

433

434

436

437

438

0,938

О, 679

О 709

О, 629

0,195

0,622

О, 799

О, 736

О, 766

1,210

О, 482

О, 498

1, 570

О, 742

0,398

1, 154

1, 209 . 0,557

1,170

0,526

0,473

1,020

0,637

О, 742

0,921

0,548

0,355

0,381

0,542

1,192

1,402

0,637

1,017

1,155

0,465

Оь 517

544

1,190

1,250

1,014

0,874

1,244

1,404

1,416

1,647 1, 621

1,073

1,145

1,600

1,186

0,801

1,603

0,864

1, 220

1, 787.

1,326

1,201

1,592

0,944

1,479

1,381

1, 116

1,184

1,051

1, 198

1,633

1,793

1, 196

1,951

1,512

1,408

О, 572

1802871

Продолжение табл.2!

25

40

512

513

514

516

517

518

439

441

4 42

"43

444

446

447

448

449

451

452

43

454

456

457

458

459

461

462

463

464

47.7

478

4оО

0,483

1,345

0,618

0,660

0,638

0,604

1,187

1., 731

2,737 .

2,150

1,580 .

2, 287

1,645

1, 741

1, 998

1,756

2, 590

1, 022

1, 055

1 706

1,133

1, 611

1,809

1,417

1, 034

2, 027

0,586

0,651

0,678

0,8О7

1, 583

1, 592

1,922

2,102

1,434

0,369

1,143

О, 422

1,380

1,23"

1, 088

1,288

0,737

1,46z

О, 662

2. 913

2,936

2,901

2,956

2,777

2,636

2 922

2,860

3,010

2,936

2, 724

2,868

z,849

2,636

2, 881

2, 788

1,536

2,936 . . 1,843

1,783

1, 554

2,180

2,670

z, 796

2,812

2, 769

1,918

О, 791

2,498

1802871

Продолжение табл.2

3 м °

1,923

2,831

2,493

1,043

2,621

0,593

2,418

520

1,107

0,509

0,825

0,829

1,456

2,311

О, 679

0,,530

1,655

1,177

0,384

1,085

1,852

1,412

15

1,093

2,764

0,350

0,905

1,147

?,590

0,407

2,644

О, 219

0,,643

Таблица3

EL1 SA тесты сравнения специФичности и селективности синтетических пептидных антигенов

Антиген

Отрицатель":: ный антиген ""

2, 809

1, 412

2,222

2,922

2,635

О, 084

0,436

12

О, 066

О, 087

0,071

0,071

0,137

0,336

0,289

0,484

О, 737

0,227

19

31

2 343

0,101

О, 090

521

522

523

524

«26

527

528

529

531

532

533

534

536

537

538

539

540

1,993

2,612

2,849

2,026

2,631

2,745

2,739

1,617

2,698

2,834

2, 7 4

1802871

О, 140

2, 289

1, 978

2, 443 г, 592

42

43

44

48

78

101

482

О, ОЬ2

О, 085

О, 073

О, 084

1,399

1, 826

О, 863

1,316

1, 036

О, 219

О, 072

0,100

О, 067

О, 081

О, 260

О, 057

o,04ь

О, 057

О, 066

О, 067

О, 082

0,142

511

140

30

0,215

0,205

0,104

О, 069

О, 029

О, 088

О, 080

О, 056

О, 067

О, 082

О, 086

О, 051

45

2,644

О, 056

О, 087

О, 043

О, 044

О, 028

О, 093

О 154

О 191

О, 156

О, 241

О, 101

277

285 г98

3г4

393

416

428

446

457

477

478

517

5гО

523

524

532

536

539

3950Û

39509

39511

39512

3ь9

2, 243

-1, 977

2,63ь

1, 299

0,957

0,874

1, 326

1, 184

o,612

2, 724

1,843

1,783

О, 791 ,1,923

1 093

2, Ь21

1,993

1,617

1, 093

О, 407

Продолжение табл.3

0,731

О, 522

1, 199

0,195

О ь 19

О, 489

О, 205

0,120

0,248

О, 952

1,106

0,437

1,204

О, 281

О, 280

0,195

О 52Ь

0,355

1, 731

1, 055

О, 586

О, 651

О, 369 о 593

0,5О9

О, 825

0,809

0,384

0,350

0,219

0,643 .О 153

0,166

О, 085

О, 177

0,144

1802871

Продолжение табл.3

О, 048

О, 051

0,063. 0,178

0,101

О, 086

0,123

0,118

О, 252

39513

39514

39515 агав е ° ФВ фй ° Э ° а ° М ° Ю Спектрофотометрический показатель, О.Д.„ ь* Не-Н.1Ч-I антиген

Отклонение = Среднее О.Д.< отрицательной сыворотки +

+ 3х9Д

Отклонение AS = 0,151 + 3 х 0,053 = О 310 (О.Д. ) Отклонение Ч(39) О, 152 .+ 3 х О, 050 О 302 (О.Д.„ )

WB блот-анализ Вестерна с использованием HIV-I антигенов

Т а б л и ц а 4

Реак-;ивность антител в образцах сыворотки с синтетическими пептидными антигенами, соответствуюцими

1ПЧ-I антигенам

15

511

140

12

19

31

42

43 .44

48

78

101

482

2, 809" 1,412

2, 222

2 922

2,635

2,343

1,495

2 289

1, 978

2,443

2, 592

1, 399

1,826

0,863

1, 316

1, 936

2,369

О, 436

0,137

0 336

О, 289

0,484

О 737

0,227

01731

0,522

1,199

О, 195

0,219

0,489, 0,205

0,120

О, 248

0,952

О> 905

О, 164

0,583

0,850

О, 532

О, 444

a,547

0,420

О, 144

О, 406

0,601

О, 098

О, 485

0,187

0,605

О, 139

0,318

О, 084

О, 066

О, 087

О, 071

О, 071

О, 101

0,090

0,140

0 062

О, 085

О, 073

О, 084

0,219

О, 072

0,100

О, 067

О, 081

1802871

ПРодолжение табл.4

40

50

««ф

Отклонение .= Среднее О.Д. «отрицательной

Отклонение AS = 0,151 + 3 х 0,053 = 0,310 сыворотки + 3 х БД

Отклонение V(39) = 0,152 + 3 х 0,050 = 0;302

Отклонение AS-Тгипс (а) = 0,166 + 3 х 0,033 = 0,265

В = блот-анализ Вестерна

Спектрофотометрический показатель, О.Д О

* Не HTV-I антиген

277

298

324

393

416

428

446

457

477

478

517

523

524

532

536

539

39508

39509

39511

39512

39513

39514

39515

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

2,243

1,977

2,636 1, 299

0,957

0,874

1, 326

1, 184

0,612

2,724

1,843

1, 783

О, 791

1,923

1, 093

2, 621

1 993

1,617

1 093

0,407

2,644

0,154

О, 191

О, 156

0,241

01101

О, 178

О, 101 о, 086

1,106

0,437

1, 204

О, 281

О, 280

0,195

О, 526

0,355

1, 731

1, 055

О, 586

О, 651

0,369

О, 593

0,509

О, 825

0,809

0,384

0,350

О, 219

О,643

О, 153

0,166

0,085

О, 177

О, 144

0,123

0,118

0,252

0,307

0,553

0,229

0,363

0,631 о 254 о,166

О, 303

0,310

0,326

О, 672

0,386

0,125

0,990

0,272

0,557 .

0, 485

О, 432

0,532

О, 147 о,334

0,2О9

О, 179

0,160

0,15.

0,156

0,131

0,130

0, 216

О, 260

О, 057

О, 046

О, 057

О, 066

О, 067

= О,.082

0,142

0,215

0,205 о,1о4

О, 069

О, 029

0,088

0,080

О, 056

О, 067

О, 082

0,086

О., 051

О, 056

О, 087

О, 043

0, 044

О, 028

О, 093

0, 048

О, 051

О, 063

1802871

Таблица.5

Реактивность синтетических пептидов, соответствующих областям HIV-I gp41, с антителами против

HIV-I в заведомо положительных сыворотках

10 (+) (+) +

+ . (+) (+) 21 + (+) +

3 +

4 +

7 +

8 +

9 +

10 +

И +

20 12 +

13 +

14 +

15 +

16. +

25 17 +

18 +

19 +

20 +

30 22 +.23 +

24Г +

?5 +

26 +

35 27 +

28 +

29 +

30 + (+) (+) + (+)

+ (+) 1802871 ф, Продолжение табл.5

31

32

33

40

45 (+) (+) 50 (+) 55

56

57

58

59

61 (+) (+) 10

63

64

6.5

66 (+) + (+) (+) 15

36

37

38

39

41

42

43

44

46

47.

48

49

51

52

53

54

55 (+) + - + (+) (+) +

1802871 (+) 67 + (+) 68 + +

+ аВ

20 70 + (+) 71 + (+) 72 +

73 + +

74 + . е

25 75 + +

76 +

77 + +

78 + (+) 79 - + (+) 30 80 +

81 .+

82 +

83 +

84 +

35 85 +

86 +

87 -+

88 . +

\ 89 +

40 90 +

91 +

92 +

93 +

94 .+

45 95 +

96 +

97 +

98 .+

99 +

50 100 +

101 + +

102 +

103 +

44 вбл,5

Продолжение т

6 г 8

1802871

Продолжение табл.5

104 +

5 106 +

107 +

108 +

110 + ю «

« °

= отрицательная реакция (+) = слабая положитеЛьная реакция

+ = сильная положительная реакция

Таблица 6

Иммунологическая реактивность пептидных антигентов, соответствующих Н Ч-1 ОА6 генному продукту

Источник сыворотки

1802871

Таблица 7

Иммунологическая реактивность антител в образцах сывороток от больных HIV- u HIV-2 спептидами, соответствующими Н!И и Й!Ч-2 генными продуктами

ЯЙЯ .

1802871

1.6

О.

n= 179

Фиг. У

Составитель И. Тареева

Техред M. Моргентал

n=101

Редактор С. Кулакова

Корректор С. Юско

Производственно-издатеакскии комбинат "Патент", г. Ужгород, уа Гагарина, 101

Заказ 862 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5