Способ определения миграции лимфоцитов в организме

 

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для определения миграции лимфоцитов в организме. Цель изобретения - повышение точности способа. Для этого животным-реципиентам вводят лимфоциты меченые люминесцентным красителем акридиновым оранжевым и затем проводят подсчет количества меченых клеток в исследуемом органе. табл.

COI03 СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУ БЛИН (51)5 С 01 " 1/30

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ABTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

В С В

А = — — — 100, E F6

ГОСУДАРСТ8ЕННЫЙ КОМИТЕТ

ll0 ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

1 (21) 4191995/14 (22) 04.02.87 . (46) 07.05.92. Бюл. У 17 (71) Свердловский государственный медицинский институт (72) М.В. Попугайло, А.M. Наливайко, А.А. Шаравара и С.P. Рябинин (53) 612.015 (088.8) (56) Успехи современной биологии„

1980, т. 89, с. 238-252

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для изучения закономерностей участия лимфоидных: клеток в механизме патологических и Физиологических лроцессов.

Цель изобретения - повышение точности способа.

Указанная цель достигается за счет того, что трансплантируемые лимФоциты метят акридиновым оранжевым при 4 С в течение 30 мин в темноте, а регистрацию клеток проводят люминисцентным методом.

Изобретение осуществляется следующим образом.

Суспензию донорских лимфоцитов (5 ° 10 - 8 107 клеток в 1 мл) инкубируют 30 мин в растворе акридинового оранжевого (1:40000 ) при 4 С в темноте. Затем клетки отмывают, пропуская суспензию через колонку с а ктивированным углем. В полученной взвеси окрашенных клеток подсчитыва„.ЯО„„1732225 А1

2 (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МИГРАЦИИ

ЛИИФОЦИТОВ В ОРГАНИЗМЕ (57) Изобретение относится к меди" цине и может быть использовано для определения миграции лимфоцитов в организме. Цель изобретения - повы шение точности способа. Для этого животным-реципиентам вводят лимфоциты меченые -люминесцентным красителем акридиновым оранжевым и затем nposoдят подсчет количества меченых клеток в исследуемом органе. 4 табл, ют количество ядросодержащих элементов общепринятыми методами. При наличии в суспензии 953 живых лимфоцитов суспензию вводят внутривенно реципиентам, которых забивают через

1,5 ч. Навеску исследуемого органа измельчают в Физиологическом раство" ре и готовят мазки, которые просмат" ривают под люминисцентным микроскопом, совмещенным с Фазовоконтрастным устройством. КФ-1. В мазках.определяют соотношение клеток, меченных акридиновым оранжевым (АО) и светящихся в ультрафиолете, ко всем ядросодержацим клеткам в поле зрения, причем

:последние подсчитывают в видимом све- те. Затем рассчитывают процент меченых клеток, находящихся в органе, :от общего количества трансплантируемых лимфоцитов по Формуле

17322 где А - измеряемый показатель;

В - количество лимфоцитов, мече" ных АО, приходящихся на шесть просчитанных клеток в мазке;

C - вес исследуемого органа, мг;

D - -количество ядросодержащих клеток в навеске органа (,10б).

E - навеска исследуемого органа, мг;

F - количество введенных реципиенту лимфоцитов, меченых АО (10)

G - общее количество клеток, подсчитанных в мазке.

Пример l. Сравнивают мигра" цию интактных лимфоцитов меченых АО и Gr . Для мечения лимфоцитов Gr 20 к 2-3 мл суспензии клеток добавляют

Иа Ст Й 1 с удельной активностью

3,7 ° 10т;Бк/мл из расчета 1,Р я

А10 Бк/105 кл/мл, инкубируют 30 мин при 37 С, периодически встряхивая. 25

Трижды отмывают в 4-5 мл среды Хенкса без Фенолового красного. Реципиентам внутривенно вводят l,0 мл суспензии, содержащей 5 t0 - 8-10 жизнеспособных клеток с общей активностью около,4 10з Бк. Радиометрию проб проводят на автоматическом счетчике

N1L-603 (ЧСР). Процент меченых клеток, находящихся в органе, от общего количества трансплантированных лим35 фоцитов рассчитывают по формуле

А=- 100, В

40

Исследование жизнеспособности меченых клеток выявляет снижение этого показателя во всех сериях эксперимента, что также связано с условиями культивирования лимфоцитов. Однако при этом наибольшее количество не 0, жизнеспособных лимфоидных клеток во все сроки наблюдения выявляется при мечении их Gr . Метка,АО не приводит к увеличению процента нежизнеспособности клеток в сравнении с контролем. TBKHM образом мючение лимфоци тов Gr сопровождается нарушением их жизнеспособности, в то время как мечение их АО подобного эффекта не вызывает.

Я где А " процент меченых Gr лимфо цитов в органе от общего ко; личества введенных лимфоцитов;

8 - радиоактивность исследуемо" го органа;

С - общая радиоактивность вве. денной суспензии меченых Gr лимфоцитов, .

Сравнивают миграцию интактных лимфоцитов, меченых AO и Gr+> e костный мозг одной бедренной кости, .печень, почки, селезенку, подчелюстиые слюнные железы через 1,5 ч пос" ле внутривенной трансплантации интактным реципиентам. Кроме того, про- водят сравнение количества ядросодержащих элементов описанным мето" дом, количества жизнеспособных клеТ0х по тесту стрипановым синим, из25 менения содержания метки АО и Gr> в лимфоцитах при. культивировании

in vitro при 37 C. Эти параметры оценивают после приготовления сус» пензии лимфоцитов сразу после мечения клеток АО и Gr через 1,5; 3 и 5 ч культивирования меченых клеток в среде Хенкса без фенолового красного и эмбриональной телячьей сыворотки. Перед каждым анализом проводят двухкратное омывание клеток центриФугированием по 10 мин при 450 g с ресуспендированием в изначальном объеме питательной среды.

Изучение количества ядросодержащих элементов в суспензиях лимфоцитов, меченых АО и Gr и немеченых (контроль), не выявляет различий между сравниваемыми группами в избранные сроки наблюдения. В табл.1 приведено количество ядросодержащих элементов в суспензиях лимфоцитов при культивировании в среде Хенкса (10 мл/л). На основании полученных данных можно полагать, что ни АО, ни

Сг при заданных условиях эксперимента не вызывают структурного разрушения лимфоцитов и не отличаются по этому критерию друг от друга. Отме" чаемое во всех трех сериях эксперимента уменьшение количества ядросодержащих элементов обусловлено неспецифическими причинами и связано с условиями культивирования и манипулирования с суспензиями и является характерным для моделей in vitro.

В табл.2 показана жизнеспособность лимфоцитов по тесту с трипоновым синим при культивировании в среде Хенкса (3) .

5 1

В табл.3 показано изменение содер жания метки в лимфоцитах при культивировании в среде Хенкса, Если при мечении лимфоцитов АО метка присутствует во всех клетках во все сроки наблюдения, то при мече нии их Gr отмечается достоверное

5( снижение радиоактивности проб, начиная с 1,5 ч культивирования, Снижение радиоактивности связано не только со снижением числа лимфоцитов в пробах, но и со спонтанной потерей r клетками в динамике культивирог 5 ! вания, так как пересчет радиоактивности проб на 10 клеток суспензии

r. также показал ее достоверное падение, Сравнение результатов распределения в организме реципиентов трансплантированных лимфоцитов, меченых

5 \

АО и Gr дает результаты, приведенные в табл.4. Если общий характер распределения меченых АО лимфоцитов существенно не отличается от- данных прототипа то доля меченых АО лимфоцитов, мигрировавших в органы, во всех случаях ниже, чем при их метке

Gr . Анализ экспериментальных данЙ ных позволяет считать, что в данном случае применение способа прототипа приводит к завышению реального. количества мигрировавших в орган лимфоцитов . Подобное завышение, приводящее к ошибке в исследовании, связано как с частичной утерей метки отдельными клетками, так и с утратой определенным количеством лимфоцитов жизнеспособности, выявленными ранее.

Это приводит к усилению реутилизации Gr клетками реципиента и неспеУ цифическому распределению метки в организме. Метка задерживается в органах с богатым кровоснабжением и большим числом клеток, способных в фагоцитазу. Причем показано, что преимущественно Gr задерживается в печени за счет поглощения его макФормула и зобретения

Способ определения миграции лимфоцитов в организме. путем мечения лимФоцитов, их трансплантации. в организм с последующим выявлением метки в ор4Q ганах, oTJlM÷àþùèéñÿòeì, что, с целью повышения точности и уп" рощения способа, в качестве метки используют краситель акридиновый оранжевый, мечение лимфоцитов прово45 дят в течение 30 мин при 4 С в темно" те, а выявление метки проводят по ее люминисценции.

73222 6 рофагами. Последнее подтверждается полученными данными (см,табл.4), свидетельствующими о том, что повышение в суспензии доли нежизнеспособных лимфоцитов, меченых ЯО, путем их нагревания, приближает результаты, полученные предлагаемым способом к данныи прототипа.

10 Из этого следует, что косвенный подсчет распределения трансплантированных лимфоцитов у реципиентов по радиоактивности органов менее точен из-за существенного неспецифическо15 го распределения метки в организме.

В предлагаемом способе лечение лимфо" цитов А0 не сопровождается утерей метки и снижением жизнеспособности меченых лимфоцитов. Кроме того, при использовании предлагаемого способа в органе учитываются меченые клетки, а не количество метки, как в прототи" пе.

Таким образом, данные сопоставительного анализа, полученные по ре25 зультатам выполнения предлагаемого и известного способов, подтверждают повышение точности способа. Кроме того, предла гаемый способ позволяет

З0 значительно упростить и снизить сто" имость его выполнения, он более эфФективен.

1732225

Т а б л и ц а 1

Контроль Лимфоциты, Лимфоциты, (без мечения) меченые AO меченые.Gr

Время исследования

После приготовления суспензии лимфоци" тов

13,44 0,42 13,2 0,47

11, 7f 0,62 12, 010,45

13,1+0,45

11,7+0,42

Сразу после метки

Через 1,5 ч после метки

11,510,62

11,310,09 10,190 74

Через 4 ч после метки

10,7 0,45 9,8 0,48

10,1 0,50

Через 5 ч после метки

9,740,45

9,840,40

9,2>0,43

П р и м е ч а н и е. Число проб n = 10 во всех случаях.

Табли ца 2

Лимфоциты, меченые Gr f

Время исследования

Лимфоциты, меченые АО

Контроль без мечения

После приготовления суспензии лимфоцитов

97,6Ы,30

97,3 0,52

97,6>0,55

96,8 0,45

97,94 0,20

95,5+0,25

Сразу после метки

Через 1,5 ч после мет ки

Через 3 ч после метки

76,9" 2,01 66,7 1,12

Через 5 ч после метки

Достоверность различий между опытными группами Р (0,05, Достоверность различий с контролем Р .0,05, Таблица 3

Радиоактивность проб лимфоцитов, меченых Сг

Время исследования

103 Бк/10 кл Процент от

10 Бк

Процент от исисходного уровня ходного уровня

Сразу после метки лимфо100 4,001,0,15

0,30340 Oll 100

100 цитов

Через 1,5 ч после метки

100 3,2440,19

Через 3 ч после мет ки

100 ?,63+0, 09 65,8у,15 0,262+0,009+ 86,5+2,87

Процент меченых

АО лимфоцитов

90,3>1 02

84,1 1,43

79,5 1,33

88,7Ф1, 52 83,3 t l, 10

80,141,13т» 75,510,98

81,0+2,88 0,270ФО, 010 89,1Ф3,14

Продолжение табл. .

1732225

Радиоактивность проб лимфоцитов, меченых Gr

Время исследования

10з бк/10 кл Процент от исходного уровня

10з

Процент от исходного уровня

Через 5 ч после метки

100 2 30 0,10 . 57,542,110 0,25Ф0,010 83,143,54

+Достоверность отличий с исходным уровнем Р(0,05 таблица4 йанные известного способа

Собственные данные

Орган

Введение жизнеспо" собных лимфоци тов"

8,3 9,010,41

Кровь

Костный мозг

3,2 0,39 2,5010,31

1 9, 41 1, 6 3 3, 2 1 > 0 > 57

1, Ы0,23 0,7110>20

1>240>20 7>53/1>09

19,0

3,0

19 7

11,0-13,0

2,0

1,2

15,3

2,0

1,0

ilNM(hBT»÷åñкие узлы

0,014

0>1-0,3

5,9

Подчелюстные слюнные железы

1,ИО>20 0>9 0>09 0,7510>15

Метка лимфоцитов Gr .

+" Метка лимфоцитов АО, >

Редактор А. Мотыль

Составитель С. Рыбалкин . Техред М.Дидик

Корректор И. Самборская

Заказ 1577 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-.35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101

Печень

Почка

Селезенка

Процент меченых

А0 лим-

Фоцитов

Ра спределение лимфоцитов в соответствии в объемом кровотока в органе

Введение лимфоци" тов, убитых наг-„ реванием

Введение жизнеспособных лимфоцитов"

4,0 0,27

18,342,71

1,310,26

14,9Ф1,11

Введение лимфоци- тов, убитых нагреванием

Введение жизнеспособных лимфоци" тов "+