Способ приготовления системы для дифференциации энтеробактерий

 

Использование: медицина, микробиология , биотехнология, Наборы для дифференциации энтеробактерий готовят путем приготовления питательных сред, содержащих раствор бромтимолового синего. Дифференциальную среду .вносят в лунки пластины, высушивают при 38-40°С и одновременно стерилизируют УФ. После подсушивания в лунки дополнительно вносят поливиниловый спирт. 1 з.п. ф-лы, 2 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИНЕСкиХ

РЕСПУБЛИК (я)5 С 12 Q 1/04

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

K АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ 4

0с

Ы) (Я (21) 4790479/13 (22) 13.02.90 (46) 07.03,92. Бюл, N - 9 (71) Горьковский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии (72) К.Я. Соколова, М.И. Рябова и И,B. Соловьева (53) 576.8.078,2(088.8) (56) Патент США М 3951747, кл. С 12 К 1/06, 1976.

Авторское свидетельство СССР

Nò 1337409, кл. С 12 Q 1/04. 1985.

Инструкция по применению системы

Rapid D 20 фирмы Api, Изобретение относится к микробиологии и касается способа приготовления дифференциальноо-диагностических сред.

Известен способ приготовления лиофилизированной среды состава, %: углевод.1; пептон 0,5; феноловый красный 0,0018; рас. творитель 100 мл.

Ингредиенты перемешивают при комнатной температуре. затем автоклавируют при 118 С в течение 15 мин, после чего.помещенные в водяную баню при 50" С микропробирки размером 10х75 мм заполняют средой. Количество среды, помещенное в каждую пробирку, составляет 0.1 мл. После заполнения пробирки помещают в камеру лиофильной сушки при -40 С и выдержива- ют 1 ч. В камере устанавливают вакуум. Затем камеру подогревают до 21 С в течение

24 ч, после чего вакуум разрушают и пробир- ки вынимают. Полученную таким образом среду хранят с осушителем и расходуют по мере надобности, „„SU, 1717635 А1 (54) СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ СИСТЕМЫ

ДЛЯ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ (57) Использование: медицина, микробиология, биотехнология, Наборы для дифференциации энтеробактерий готовят путем приготовления питательных сред. содержащих раствор бромтимолового синего, Дифференциальную среду. вносят в лунки пластины, высушивают при 38 — 40 С и одновременно стерилизируют УФ. После подсушивания в лунки дополнительно вносят поливиниловый спирт. 1 з.п. ф-лы, 2 табл.

Недостатками данного способа являются сложность, длительность (25 ч) и многоэтапность, а также необходимость использования осушителя при хранении.

Известен также способ получения пита тельной среды для идентификации энтеробактерий состава, г/л: основной субстрат— лимоннокислый натрий 5,0-6.0; еспоМогательные субстраты — глюкоза 0,6 — 0,7; калий фосфорнокислый однозамещенный 0,81,0; пептон 1,0-1,2; цистеин 0,02-0,04, фосфорнокислый аммоний 0,5-0,7; хлористый натрий 5,0 — 7.0; индикаторы — бромтимоловый синий 0,08 — 0,1; крезоловый красный

0.08-0,1: дистиллированная вода остальное.

Среду разводят в десятикратно меньшем обьеме воды и микродозируют по

0.02 мл в ячейки полимерного планшета, высушивают, стерилизуют ультрафиолетом. (УФ) и герметизируют. Для стабилизации среды добавляют поливиниловый спирт (ПВС) на этапе растворения в количестве

1717035

50

0,8-1 г/л. В таком виде среда долго хранится.

Технологические возможности способа могут быть расширены, увеличена номенклатура сред, приготавливаемых в пластинах биохимических, дифференцирующих энтеробактерии.

Известен способ приготовления системы для дифференциации энтеробактерий

RapidO 20Е фирмы Api, который основан на выявлении биохимической активности микроорганизмов в отношении сахаров и аминокислот путем приготовления набора дифференцирующих питательных сред, содержащих субстрат и индикатор с последующим разливом среды в лунки пластины, высушиванием и стерилизацией.

В качестве аминокислот в данной системе используют лизин и орнитин, а в качестве индикатора — бромкрезоловый пурпурный, высушивание ведут путем лиофилизации, стерилизацию проводят при помощи автоклава (по традиционно сложившейся практике создания систем данного вида).

Известный способ не всегда обеспечивает т ность дифференциации, слажен изза необходимости использования дополнительного оборудования (автоклава, установки для лиофилизированной сушки), Целью изобретения является повышение точности дифференциации и упрощение приготовления и использования системы.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу приготовления системы для дифференциации энтеробэктерий, оскованному на выявлении биохимической активности микроорганизмов в отношении сахаров и аминокислот путем приготовления набора дифференцирующих питательных сред, содержащих субстрат и индикатор с последующим разливом среды в лунки пластины, высушиванием и стерилизацией, в состав среды в качестве аминокислоты вводят аргинин, а в качестве индикатора — спиртовой раствор бромтимо-. лового синего, а высушивание пластин ведут при 38-40ОС с одновременной стерилизацией ультрафиолетом; а также

- тем, что в лунки пластины после высушивания среды вносят поливиниловый спирт.

Включение теста с аминокислотой— аргинином обусловлено его большой диагностической значимостью. Данный тест является ключевым при диффервнциации микроорганизмов рода Entегоbecter. Тест. на аргининдигидролазу — один.из основных дифференцирующих Citrebecter

amaionaticus от других видов этого рода и является также разделяющим род Klebslella от рода Entегоbacter наряду с тестом нэ подвижность. Таким образом, введение в состав системы теста нэ аргинин повышает ее точность, упрощает идентификацию, избавляет от необходимости использования дополнительных тестов.

Предварительное растворение индикатора брамтимолового синего в этиловом спирте способствует более тщательному его растворению, чем, если бы его растворяли вместе с остальными компонентами среды с применением воды. Использование в качестве растворителя для смеси компонентов этилового спирта приводит к перенасыщению среды алкоголем, и полученная среда обладает большим ингибирующим эффектом по отношению к выращиваемым на среде микроорганизмам, Режим высушивания при 38 — 40 С является наиболее оптимальным, так как эта температура неблагоприятна для развития микроорганизмов и не приводит к деформации полимерного планшета, в котором находится среда, Одновременное облучение УФ ведет к сокращению времени получения среды и обеспечивает условия стерильности на всем протяжении этапа высушивания. Кислая среда, необходимая для активизации декарбоксилазы аминокислот (рН 5,0), делает невозможным внесение в раствор ПВС, так как данный рН среды способствует его свертыванию, Поэтому для обеспечения стабильности ва время хранения ПВС вносят после этапа высушивания, Пример 1. Различные концентрации компонентов среды приведены в табл. 1.

В качестве аминокислоты используют эргинин. Сухие компоненты среды смешивают, добавляют витамин и йредварительно приготовленный индикатор-бромтимоловый синий, затем полученную смесь доводят до

100 мл стерильной дистиллированной водой, устанавливают рН 5,0, дозируют по

0,02 мл в ячейки дифференцирующей пластины и сушат при 40ОС с одновременной стерилизацией УФ-лучами.

Испытание среды проводят с помощью контрольных штаммов микроорганизмов.

Результаты испытаний на примере среды с аминокислотой — аргинином представлены в табл. 2.

Результаты испытаний показали, что s опыте с 5-й композицией среды (с самым минимальным содержанием составляющих компонентов) наблюдаются нестабильные результаты, запаздывание ферментации, и эти реакции расцениваются как отрицательные.

1717635

Таблица 1

Так, например, у Citrobacter аваlonaticus u Entегоbacter cloacae (табл. 2) отмечены отрицательные результаты при положительном контроле (s качестве контроля используют классическую среду Бирге- 5 ра — Крушинской), Композиции 1 — 4 испытывают в тех же условиях, что и композицию 5, Данные среды работают хорошо, положительные результаты фиксирутся в срок, окраска индикатора при положитель- 10 ной реакции контрастная по отношению к окраске отрицательной реакции, Композиция 1 исключена из экономических сообра>кений, так как нецелесообразно . дополнительно расходовать реагенты при 15 хороших результатах на средах с меньшим их содержанием.

Таким образом, композиции 2-4 выбраны как оптимальные.

Пример 2. Осуществляют как пример 20

1. Готовят композицию 3 (табл. 1), меняют диапазон температуры сушки от 38 до 40ОС.

Оптимальная температура сушки, выбранная в пределах 38 — 40"С, неблагоприятная для развития микробов, кроме того, темпе- 25 ратура ниже 38 С значительно затягивает сроки сушки, что отражается на качестве препарата. -Температура выше 40 С разрушает некоторые компоненты среды и ведет к деформации полихлорвинилового план- 30 шета, в который разлиты среды.

Пример 3. Осуществляют как примеры

1 и 2. Готовят композицию 3 за исключением вводимого количества индикатора. К композиции 3 (без индикатора) прибавляют 35 индикатор в различных объемных процентах {от 9 до 13%), Полученные варианты сред высевают на бактериальную контаминацию.

Вариант с 9%-ным содержанием этила- 40 вого спирта признан непригодным, так как при высеве на стерильность наблюдается рост микроорганизмов .выше, допустимой нормы (20 колоний на 1 чашку). Варианты с

10-13%-ным содержанием этилового спирта пригодны; наблюдается допустимый рост микробов, Таким образом, варианты среды с 10 — 12%-ным содержанием этилового спирта признаны оптимальными. Вариант с

13%-ным содержанием этилового спирта не учитывается из-за удовлетворительных результатов на вариантах среды с более низким его содержанием.

Предлагаемый способ позволяет приготовить дифференциально-диагностические среды разного состава, которые в совокупности могут образовывать идентификационную систему одноразового использования. пригодную для полевых условий. Сокращается время приготовления среды за счет совмещения стерилизации с высушиванием.

Формула изобретения

1. Способ приготовления системы для дифферей4иации энтеробактерий, основанный на выявлении биохимической активности микроорганизмов в отношении сахаров

;«ф и аминокислот путем приготовления набора дифференцирующих питательных сред, содержащих субстрат и индикатор,с последующим разливом среды в лунки пластины, высушиванием и стерилизацией. о т л и ч аю шийся тем, что, с целью повышения точности дифференциации, упрощения приготовления и использования,. в состав среды в качестве аминокислоты вводят аргинин, а в качестве индикатора — спиртовой раствор бромтимолового синего, а высушивание пластин ведут при 38-40ОС с одновременной стерилизацией ультрафиолетом.

2. Способ по и. 1 ° о т л ич а ю щи и с я тем. что в лунки пластины после высушивания среды вносят поливиниловый спирт, 1717Ь35

Таблица 2

Составитель И,Соловьева

Редактор И.Дербак Техред М.Моргентал Корректор И.Муска

Заказ 853 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.ГRI àðèíà, 101