Способ определения супероксиддисмутазной активности в биологическом материале

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (ss>s G 01 N 33/68

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4730891/14 (22) 22,08.89 (46) 15.12.91. Бюл. М 46 (71) Минский государственный медицинский институт (72) Г.Н.Смелянская и А.И,Балаклеевский (53) 612.015 (088,8) (56) J.Â.Ñ., 1972, ч. 247, М 10, р, 3170. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СУПЕРОКСИДДИСМУТАЗНОЙ АКТИВНОСТИ В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ

Изобретение относится к биологии и медицине и может быть испоЛьзовано для определения активности супероксиддисмутазы в биологическом материале в экспериментальных и клинических исследованиях, а также при оценке активности коммерческих препаратов фермента.

Цель изобретения — повышение специфичности чувствительности способа, Цель достигается тем, что определение активности супероксиддисмутазы осуществляется путем иикубации содержащего ве биологического материала с 6-оксидофами- ном и десфериоксамином (десфералом) в фосфатном буфере при рН 7,0 7,5 с последующим фотометрированием. окрашенного продукта аутоокисления 6-оксидофамина.

На фиг. 1 представлена кривая зависимости степени торможения аутоокисления

6-оксидофамина в присутствии десфериок . самина от концентрации супероксиддисмутаэы; на фиг, 2 — кинетика аутоокисления

6-оксидофамина в присутствии супероксиддисмутазы гемолизата эритроцитов крови крыс; на фиг, 3 — влияние агентов, связываЯ2, 1698786 А1 (57) Изобретение относится к биологии и медицине и может быть использовано для определения супероксиддисмутазной активности в экспериментальных и клинических исследованиях, а также при оценке активности коммерческих препаратов фермента, Цель изобретения — повышение чувствительности и специфичности способа— достигается за счет использования 6-оксидофамин в качестве субстрата аутоокисления и десфериоксамина в качестве хелатирующего агента. 4 ил. ющих ионы металлов с переменной валентностью, на кинетику аутоокисления 6-оксидофамина; на фиг. 4 — влияние рН на активность супероксиддисмутаэы гемолизата эритроцитов крыс, Способ осуществляется следующим образом.

В пробу вносят 0,1 М раствор фосфатного буфера, рН 7,0-7,5, затем последовательно добавляют биологический материал, содержащий супероксиддисмутазу, раствор, содержащий 6-оксидофамин и десфериоксамин, до конечной концентрации . 2,5 10 M и 5 10 М соответственно. Содержимое пробы перемешивают и при комнатной температуре (18-25 С) регистрируют увеличение оптической плотности пробы при длине волны освещения 490 нм (максимум абсорбции). во времени или через определенный временной промежуток. Об активности фермента судят по степени торможения развития окраски, как принято в других известных методах.

Пример. Готовили следующие реактивы: 1-0,1 М фосфатн ый буфер с р Н 7,5; 2-5

1698786 активности фермента

40

«10 М раствор 6-оксидофамина на 0,01 M

НО, стабилизированный десфериоксамином (1 10 M), который готовится непосредст-з венно перед опытом. Для этого приготовленную с точностью 0,01 мг навеску

6-оксидофамин бромида (2,5 мг), растворяют в 2 мл 0,01 M раствора HCI и добавляют 1,32 мг десфероксамина (M.Ì. 659). Раствор перемешивают и получают реактив 2 в количестве, достаточном для 20 проб.

Препарат, содержащий супероксиддисмутазу(СОД) крови человека, готовят способом, предложенным J.M.McCord апб

1. ЕгЫОИСЬ, К 0,1 мл эритроцитарной массы добавляютт 2,9 мл 0,005 M трис-HO буфера, рН 7,5,.

Оставляют. на 0,5 ч в ледяной бане для образования гемолиэата. К 1 мл гемолизэтэ добавляют 0,4 мл смеси хлороформ — метанол (3:5), интенсивно встряхивают и центрифугируют 5 мин при 3000g.

Освобожденный таким образом от гемоглобина супернатант используют в качестве частично очищенного препарата СОД крови.

Для построения калибровочного графика, необходимого при расчете активности фермента по степени ингибирования аутоокисления 6-оксидофамина, готовят ряд проб, в которых к 1,5 мл реактива 1 добавляют различные обьемы препарата СОД, содержащие разное количество фермента.

Обьем проб доводят до 1,9 мл 0,005 М трисHCI буфером, рН 7,5. 8 контрольную пробу добавляют 0,4 мл указанного буфера вместо препарата, содержащего СОД. Реакцию начинают добавлением 0,1 мл реактива 2. Регистрируют изменение во времени оптической плотности среды инкубации при длине световой волны 485 нм при комнатной температуре.

Исследования показали, что степень ингибирования окисления 6-оксидофамина в присутствии десфериоксамина меняется пропорционально концентрации супероксиддисмутаэы, что позволяет построить нормальный калибровочный график зависимости степени ингибирования образования окрашенного продукта в среде от количества (концентрации) фермента для расчета его активности в общепринятых единицах.

Наличие десфериоксаминэ в исходном растворе 6-оксидофамина предохраняет последний от аутоокисления кислородом, растворенным в воде, что позволяет исключить процедуру деаэрации реагента. Одновременно в инкубационной среде десфериоксамин ингибирует побочные реакции окисления 6-оксидофамина, не включающие его взаимодействие с супероксидным радикалом, что значительно повышает специфичность способа по сравнению с другими известными способами определения

Применение других известных хелаторов ионов металлов, таких кэк этилендиаминтетраацетат (ЭДТА} и альбумин сыворотки крови, не предохраняет 6-оксидофамин от аутоокисления, а напротив. ускоряет его и несколько снижает специфичность и чувствительность способа определения активности супероксиддисмутазы. Наибольшая активность супероксиддисмутазы, определяемая предлагаемым способом, проявляется при рН 7,0-7,5, что позволяет вести определение при рН, соответствующих его физиологическим показателям в крови и большинстве других тканей организма. Предлагаемым способом проведено определение активности супероксиддисмутазы как в очищенных препаратах фермента, так и в частично очищенном биоматериале (освобожденном от гемоглобина гемолизате крови человека и животных, гемогенате мозга), Предлагаемый способ характеризуется высокой чувствительностью, точностью и специфичностью.

Формула изобретения

Способ определения супероксиддисмутазной активности в биологическом материале путем инкубации исследуемого образца. в буферной системе. содержащей донор супероксид-анионрадикала и хелатирующий агент, с последующим фотометрическим измерением содержания продукта аутоокисления донора под действием генерируемого им супероксид-анионрадикала, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью повышения специфичности и чувствительности способа, инкубацию проводят в фосфатном буфере при рН 7,0-7,5, в качестве хелатирующего агента используют десфериоксамин, а в качестве аутоокисляющегося донора супероксид-анионрадикала 6 оксидофамин в концентрациях соответственно 5 . 10 5 и 2,5 10 M.

3698786

$$ ингибирования

2 мин.

5 иин.

10 мин

° м6

Фиа2

7698786

О,Д 0,5 . 5 % инаибиуоэаюж

L,0

ФиаЯ

О,I 0,5

Белок у к " мл пробы н3 ( кг.ма щюбн

1698786

0,500

0,300

0,200

0,100

Составитель А.Агуреев

Редактор Л.Веселовская Техред М,Моргентал

Корректор С.Черни .

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Заказ 4392 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб.. 4/5