Способ подготовки смеси белков и гликопротеидов к анализу с помощью молекулярных зондов

Авторы патента:

G01N33/68 - с использованием протеинов, пептидов или аминокислот

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для подготовки смеси белков и гликопротеидов к анализу с помощью молекулярных зондов. С целью упрощения и ускорения способа, включающего изоэлектрическое фокусирование на ультратонком полиакриламидном геле, закрепленном на полимерной подложке , и злектрофоретический перенос, в качестве подложки используют целлофан, электрофоретический перенос осуществляют с ансамбля, состоящего из ультратонкого геля с целлофановой подложкой и нитроцеллюлозной мембраны, наложенной на поверхность геля.1 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (!9) (1!) (s!)s G 01 N 33/68

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4641445/14 (22) 27.12.88 (46) 30.09.91. Бюл. М 36 (71) Институт прикладной молекулярной биологии (72) А.В.Яхъяев, И.М.Воронкова и В.А.Суханов (53) 612.015 (088.8) (56) Electrophoresls, 1987, М 8, р. 140-143. (54) СПОСОБ ПОДГОТОВКИ СМЕСИ БЕЛКОВ И ГЛИКОПРОТЕИДОВ К АНАЛИЗУ С

ПОМОЩЬЮ МОЛЕКУЛЯРНЫХ ЗОНДОВ (57) Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для подгоИзобретение относится к биохимии и молекулярной биологии, конкретно к способам анализа биополимеров, и может быть использовано для аналитических и диагностических целей, когда белки и гликопротеиды анализируются с помощью антител, лектинов, иммуноферментных методов и т.д.

Целью изобретения является упрощение и ускорение способа за счет сокращения стадий.

Цель достигается тем, что в способе подготовки, включающем разделение смеси биополимеров путем изоэлектрического фокусирования на ультратонком ПААГ с полимерной подложкой с последующим переносом разделенных биополимеров электроблоттингом на нитроцеллюлозную мембрану (НЦМ) и их анализом с помощью высокомолекулярных зондов, отличием яв,ляется то, что в качестве полимерной подложки используют целлофан. ЦеллофанвЂ” листовой материал, получаемый из регенетовки смеси белков и гликопротеидов к анализу с помощью молекулярных зондов. С целью упрощения и ускорения способа, включающего изоэлектрическое фокусирование на ультратонком полиакриламидном геле, закрепленном на полимерной подложке, и электрофоретический перенос, в качестве подложки используют целлофан, электрофоретический перенос осуществляют с ансамбля, состоящего из ультратонкого геля с целлофановой подложкой и нитроцеллюлозной мембраны, наложенной на поверхность геля,1 табл. рированной целлюлозы, толщиной около

0,02 мм. В способе используют влагопроницаемый целлофан (бывает еще влагонепроницаемый, покрытый нитроцеллюлозным лаком).

Электроблоттинг в этом случае проводят с геля, сцепленного с подложкой. При этом на гель накладывают Н ЦМ и по 2 кусочка предварительно вымоченного в 0,7ф, УК ватмана (фильтровальной бумаги) и помещают. такой "сэндвич" в аппарат для электроблоттинга.

Указанные отличия позволяют не проводить операцию пресс-блоттинга, необходимую в прототипе, а операция снятия нитроцеллюлоэной мембраны с геля после электроблоттинга упрощается и занимает всего 2-3 мин {вместо 30 мин в прототипе).

Способ осуществляют следующим о6разом.

Готовят ПААГ нужного состава и размеров. Для этого к стеклянной пластинке нуж1681265 ного размера притирают вымоченный в воде целлофан, заливают деаэрированный раствор мономеров акриламида и бисакриламида с добавками, необходимыми для полимериэации и последующего разделения белков, накладывают формообразующую пластинку, зажимают прищепками и оставляют до полной полимеризации (примерно 1 ч).

После полимеризации переносят гель на охлажденный столик прибора для изоэлектрического фокусирования, накладывают электродные полоски, вымоченные в анолите и католите, и проводят предфокуси. ровку 10 вЂ” 20 мин. Затем наносят в щели аппликатора, наложенного на гель;2 вЂ” 4 мкл белковой смеси (3-10 мкг/мкл) и проводят изоэлектрическое фокусирование белков

30-60 мин при 400 В, а затем удаляют остатки белковой смеси и фокусируют 1-1,5 ч при

1500-2000 В. Сразу после фокусировки собирают "сэндвич", состоящий из 2-3 кусочков фильтровал ьной бумаги, предварительно вымоченной в 0,7 УК, геля с подложкой, НЦМ и сверху 2-3 кусочка фильтровальной бумаги. Важно, чтобы между гелем и НЦМ не оставалось пузырьков воздуха. Всю стопку помещают в .прибор для блоттинга с учетом полярности так, чтобы белки двигались из геля к мембране.

Электроблоттинг проводят при напряженности поля 10 В/см 10-150 мин, в зависимости от молекулярной массы переносимых белков. В способе используют целлофан фирмы ЛКБ (Швеция) или мембрану гидратцеллюлозную для гемодиализа (ТУ 6 06-47580), целлофан TY 6-06-439-78.

П р и и е р. Готовят гель в соответствии с укаэанным описанием и проводят изоэлектрическое фокусирование (ИЭФ) мембранных белков и гликопротеидов, выделенных из легких. Гель с разделенными белками и гликопротеидами снимают с аппарата для ИЭФ и накладывают на него

НЦМ, предварительно вымоченную в 0,7

УК. Сверху накладывают 2 куска ватмана

ЗММ, переворачивают полученный "сэндвич" и со стороны подложки также накладывают 2 кусочка ватмана. Этот ансамбль помещают в держатель аппарата для электроблоттинга (НЦМ) со стороны катода

5 (вЂ” ) и проводят перенос в течение 2 ч при

10 С.

После электроблоттинга анализируют гликопротеиды на НЦМ с помощью лектина

Coll-A, выявляя углеводную специфичность

10 этих гликопротеидов.

В таблице приведена характеристика способа в сравнении с прототипом, Использование предложенного способа позволяет ускорить известный способ и

15 упростить его, так как нет необходимости снимать гель с подложки и с особой осторожностью снимать НЦМ с геля, так как не требуется пресс-блоттинг и НЦМ не прилипает к гелю. Увеличивает воспроизводи20 мость и надежность метода, так как исключается повреждение геля в процессе удаления, подложки. Увеличивается точность метода, так как исключается сдвиг по. лос разделенных белков и гликопротеидов

25 относительно друг друга вследствие изменения размеров геля, который может набухать или сниматься, не будучи прикрепленным к подложке,.

Формула изобретения

30 Способ подготовки смеси белков и гликопротеидов к анализу с помощью молекулярных зондов, включающий проведение изоэлектрофоретического фокусирования смеси в ультратонком полиакриламидном

35 геле, закрепленном на полимерной подложке, электрофоретического переноса разделенных компонентов на твердую матрицу с последующим анализом на ней компонентов с помощью молекулярных зондов, о т40 лича ющийся тем,что,сцельюупрощения и ускорения способа за счет сокращеня стадий, в качестве подложки используют целлофан, а электрофоретический перенос осуществляют с системы, состоящей из ге45 ля, закрепленного на целлофановой подложке, на нитроцеллюлозную мембрану, помещенную на поверхность геля.

1681265

Основные этапы способа

В емя необхо имоенака ом этапе и ототип и е оженное

4ч

0,5ч

4ч

0,5 ч

0,5 ч ависит от задачи и выбранной методики

Итого: до7,5ч добч

Составитель А. Агуреев

Редактор Т. Пилипенко Техред M.Ìîðãåíòàë Корректор Н. Король

Заказ 3310 Тираж 387 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Подготовительная работа и разделение белков и гликопротеидов

Пресс-блоттинг с предварительным вымачиванием геля

Электрофоретический перенос (электроблоттинг)

Снятие НМЦс геля

Анализ белков и гликопротеи овнамемб ане до2ч до2ч

0,5 ч 2-3 мин

Способ подготовки смеси белков и гликопротеидов к анализу с помощью молекулярных зондов

Изобретение относится к медицине, в частности к хирургии и реаниматологии

Способ определения крайне тяжелой формы менингококковой инфекции у детей // 1677637

Изобретение относится к медицине, в частности к педиатрии, и найдет применение в клинической практике для своевременной точной диагностики крайне тяжелых форм менингококковой инфекции, выбора метода лечения, контроля эффективности проводимой терапии

Способ определения ингибиторов трипсина в сыворотке крови // 1675776

Способ определения индивидуальной чувствительности больных язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки к микроволновой резонансной терапии // 1675775

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для прогнозирования эффективности микроволновой резонансной терапии

Способ диагностики сахарного диабета // 1675774

Изобретение относится к медицине, а частности к эндокринологии, и woxf т бить использовано для диагностики сахарного диабета

Способ прогнозирования течения инсульта // 1673979

Изобретение относится к области медицины и касается способов прогнозирования течения инсульта

Способ прогнозирования течения инфаркта миокарда // 1673978

Изобретение относится к медицине, в частности к кардиологии, и может быть использовано для прогнозирования течения инфаркта миокарда /ИМ/

Способ диагностики язвенной болезни двенадцатиперстной кишки // 1673977

Изобретение относится к области медицины и касается способов диагностики язвенной болезни

Способ дифференциальной диагностики нефролитиаза // 1673976

Изобретение относится к области медицины, в частности к уронефрологии, и может быть использовано для дифференциальной диагностики нефролитиаза

Способ диагностики интоксикации этилендиамином // 1672370

Изобретение относится к медицине, а именно к токсикологии, и может быть использовано в поликлинических и клинических условиях при периодических осмотрах работающих в контакте с этилендиамином

Способ оценки эффективности замещения костного матрикса при трансплантации в ходе оперативного лечения костной опухоли // 2101708

Изобретение относится к медицине, а именно к ортопедии

Способ прогнозирования осложненного течения острого панкреатита // 2102764

Изобретение относится к области медицины, а именно к прогнозированию течения острого панкреатита

Способ дифференциальной диагностики клинических форм бруцеллеза у людей // 2103687

Изобретение относится к медицине, а, именно, к диагностике бруцеллеза цитохимическими методами

Способ оценки состояния больного // 2103692

Изобретение относится к медицине, а именно к клинической биохимии и может быть использовано для диагностики и прогнозирования состояния больного в послеоперационном периоде и при развитии острого воспалительного процесса

Синтетические олигопептиды, специфически взаимодействующие с антителами к вирусу гепатита с, способы диагностики hcv- инфекции (варианты) // 2104284

Изобретение относится к медицине, молекулярной биологии и вирусологии и представляет собой биологически активные соединения - синтетические олигопептиды, соответствующие аминокислотным остаткам (а

Способ ранней диагностики послеродового эндометрита // 2104529

Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству и гинекологии, и может быть использовано для ранней доклинической диагностики послеродового эндометрита, одного из гнойносептических постгестационных заболеваний

Способ прогнозирования развития цилиохориоидальной отслойки после внутриглазной операции // 2104548

Изобретение относится к медицине, а именно к офтальмологии, и может найти применение после внутриглазных операций для своевременного принятия профилактических мероприятий

Способ диагностики атрофического эндобронхита // 2104549

Способ определения эффективности иммуноцитотерапии у больных с опг-гестозами // 2105311

Изобретение относится к медицине, в частности к акушерству, и может найти применение в оценке эффективности терапии гестозов

Способ оценки завершенности формирования соединительнотканного рубца у больных, перенесших инфаркт миокарда // 2105983

Изобретение относится к медицине, а именно к кардиологии, и может быть использовано для установления завершенности патологического процесса при инфаркте миокарда (ИМ)