Способ получения цитохрома р-450

 

Изобретение относится к микробиологии , а именно к способам получения ферментов из культуры микроорганизмов. Целью изобретения является ускорение способа за счет сокращения времени индукции фермента. Способ заключается в том. что используется 18-часовая культура клеток Acholeplasma laldlawii, штамм ИЭМ-1, а в качестве индуктора - толуол в концентрации 0,01 об.%. Через 3 ч роста культуры в присутствии толуола клетки используют для получения индуцированного цитохрома. Выход составляет 1,5 ммоль/мг белка или 40-45 ммоль/r сырых клеток 2 табл

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

tsi)s С 12 N 1/38

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ,"- :.-:;;. : . . .

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЦИТОХРОМА

P-450 О (21) 4770436/13 (22) 28.11.89 (46) 23.11,91. Бюл. ¹ 43 (71) Научно-исследовательский институт физико-механической медицины (72) В. М, Говорун и А. Б, Капитанов (53) 577.15.07(088.8) (56) 1, Соколов Ю. И., Аветисова С. М., Давыдов Е. P. Выделение, очистка и свойства цитохрома P-450 из дрожжей рода Candida, выращенных на н-лаканах. — Биохимия, 1986, т, 51, N 10, с. l 649-1654.

2. Narhi i, О., Fulca А. J. Phenobarbital.

Jnduction of a зоЬЫе Cytochrome р-450-dependent Fatty Acid Monooxygenase ln

Bacillus megaterium, — Journal of Biological

Cgemistry, 1982, ч. 257, р. 2147-2152.

Изобретение относится к микробиологии, а именно к способам получения ферментов из культуры микроорганизмов.

Известен способ получения дрожжевого цитохрома P-450 (11.

Недостатком способа является то, что свойства фермента, получаемого согласно этому способу, могут определяться липидным окружением.

Наиболее близким в предлагаемому является способ получения растворимого цитохрома P-450 из Вас!(!из megatherium (2).

Целью изобретения является ускорение способа эа счет сокращения времени индукции фермента.

Способ заключается в том, что используется 18-часовая культура клеток

Acholeplasma laidlawii, штамм ИЭМ-1, а в качестве индуктора — толуол в концентрации 0 01 об. g,, Через 3 ч роста культуры в

„„5U „„1693043 A1 (57) Изобретение относится к микробиологии, а именно к способам получения ферментов из культуры микроорганизмов.

Целью изобретения является ускорение способа за счет сокращения времени индукции фермента. Способ заключается в том. что используется 18-часовая культура клеток Acholeplasma taidlawii, штамм ИЭМ-1, а в качестве индуктора — толуол в концентрации 0,01 об.;ь. Через 3 ч роста культуры в присутствии толуола клетки используют для получения индуцированного цитохрома.

Выход составляет 1,5 ммоль/мг белка или

40-45 ммоль/г сырых клеток. 2 табл. присутствии толуола клетки используют для получения и характеристики индуцированного цитохрома.

Штамм ИЭМ-1 клеток Acholeplasma

laidlawii депонирован в лаборатории микроплазм и (= форм бактерий НИИЭМ им, Н.

Ф. Гамалеи, Пример. Культивирование клеток проводят на среде, 1 л которой содержит, r: триптоза 20; ацетат натрия 5; хлористый натрий 5; хлористый калий 1,3; трис 3,4; рН

8,0-8,2. Перед посевом клеток в среду добавляют сыворотку крупного рогатого скота до концентрации 5 об.Я„глюкозу до 1 об.7; и пенициллин 500 ед./мл. Культивирование клеток проводят при 37 С в течение 18 ч.

После этого в культуру вносят толуол до конечной концентрации 0,01 об.7, и выращивают еще 3 ч при постоянном встряхивании в колбе с притертой крышкой. Затем клетки

1693043 осаждают центрифугированием на центрифуге при 10000 g в течение 10 мин и дважды отмыва!от в том же режиме средой, содержащей 200 мМ хлористого натрия, 2 мМ

ЭДТА, 50 мМ трис-HCI, рН 7,4. Осадок клеток суспендируют в 0,132 М К-фосфатном буфере или 100 мМ трис-НС! буфере, рН 7,4, и замораживают при — 20 С. Клетки и цитозольную фракцию используют для определвния активности полученного цитохрома в течение 3-5 дней.

Получение цитозольной фракции проводят следующим образом.

Клетки лизируют при комнатной температуре в бидистиллированной воде с добавлением амидопирина до конечной концентрации 2 мМ (защита цитохрома от инактивации) в течение 30 мин. Далее осаждают неразрушеные клетки при 12000 g в течение 20 мин, а полученный супернатант центрифугируют при 105000 g в течение 1;5 ч для осаждения мембран. Полученный супернатант концентрируют при+4 С в течение 3-5 ч, используя фильтр. Цитоэольная фракция имеет конечную концентрацию белка 2-5 мг/мл. Концентрацию белка определяют микробиуретавым методом, Содержание цитохрома P-450 в полученном препарате определяют по методу

Омура и Сато, используя коэффициент молярной экстинкции для P-450, равный 91. мМ см, а для P-420-111мМ см

Содержание цитохрома Р-450 в контрольных (не индуцированных) клетках составляет 0,05-0,08 нмоль/мг белка, а в индуцированных — 1,2-1,5 нмоль/мг белка.

Абсолютный спектр восстановленного дитионитом и окисленного цитохрома записывают в диапазоне длин волн от 650 до 400 нм на спектрофотометре М-40, Дифференциальный спектр цитохрома клеток

Acholeplasma laldlawii, штамм ИЭМ-1 при индукции его толуолом совпадает со спектральными характеристиками фермента из

Pseudomonas putlda.

Выход цитохрома P-450 40-45 нмоль/мл сырых клеток.

Характеристические максимумы цитохрома P-450 при его индукции толуолом в клетках Acholeplasma laidlawii, штамм ИЭМ1: окисленный 580, 530, 418 нм; восстановленный 550, 408 нм, Для клеток Ps. putida: окисленный 570, 535, 418 нм; восстановленный 540, 408 нм.

Субстратную специфичность полученного фермента проверяют следующим образом. 1 мл инкубационной смеси при определении скорости деметилирования амидопирина содержит 100 MM К-фосфатного.буфера, рН 7,6, 8 MM амидопирина и 2-4 об. близка к насыщающей.

Данные, показывающие зависимость содержания цитохрома P-450 в клетках А.

45 laidlawii, штамм ИЭМ-1 при использовании

18-часовой культуры и толуола в концентрации 0,01 об. от времени индукции средние значения иэ 3 опытов) приведены в табл. 1.

Данные, показывающие зависимость

50 содержания цитохрома P-450 в клетках А, laidlawii, штамм ИЭМ-1 от концентрации толуола и возраста культуры (средние значения из 3 опытов) приведены в табл. 2.

Формула изобретения

55 Способ получения цитохрома P-450, включающий введение химических соединений-индукторов в среду роста культуры микроорганизмов. отличающийся тем, что, с целью ускорения способа за счет сокращения времени индукции фермента, в

40 мг цитозольного белка. Реакцию запускают добавлением 6 MM НАДФН.

Смесь инкубируют при постоянном встряхивании при 27 С в течение 30 мин.

После инкубации реакцию останавливают добавлением 0,4 мл 15 ТХУ. Пробы центрифугируют при 5000 g в течение 15 мин. Для определения формальдегида отбирают

1 мл надосадочной жидкости и приливают 2 мл реактива Наше (0,26 мл ацетилацетона, 0,29 мл ледяной уксусной кислоты и 15,4 уксуснокислого аммония на 100 мл реактива). Пробы инкубируют 45 мин в водяной бане при 37 С и измеряют оптическую плотность при длине волны 412 нм.

Скорость деметилирования кодеина и диметиланилина определяют также по концентрации образующегося в ходе реакции формальдегида, При этом инкубационная смесь содержит 6 мМ кодеина или 6 мМ диметиланилина. Для построения калибровочных кривых используют стандартный

40%-н ый форма л ьдегид.

Гидроксилазная активность цитоэольной фракции составляет по амидопирину 1,6 нмоль/мл белка, по кодеину — 2,4 нмоль/мл белка, по диметиланилину — 3,5 нмоль/мг белка

Таким образом, при индукции цитохрома P-450 в клетках Acholeplasma laldlawii. штамм ИЭМ-1 наблюдается увеличение его содержания в расчете на 1 мг белка приблизительно в 30 раз.

При времени индукции, меньшем или большем чем 3 ч, внутриклеточное содержание фермента меньше максимального.

Меньший эффект наблюдается и при использовании меньшей концентрации толуола или более молодой культуры. Большую концентрацию индуктора использовать нецелесообразно, так как концентрация 0,01

1693043

Таблица 1

Таблица 2

Составитель А.Семенов

Редактор О.Юрковецкая Техред M.Ìîðãåíòàë Корректор T.Ìàëåö

Заказ 4051 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушскэя наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина, 101 качестве микроорганизма используют культуру клетки Acholeplasma laidlawll, штамм

ИЭМ-1, а в качестве химического соединения-индуктора — толуол в концентрации 0.01 об., который вводят в среду роста 18-часовой культуры и доращивают ее 3 ч.