Регулятор роста и способ повышения биохимической активности микроорганизмов и растений
Изобретение относится к органической химии и биотехнологии, а именно к регулятору роста растений и микроорганизмов. Регулятор роста содержит раствор биологически активного вещества - 2-оксо-(3Н)-5,6,7,8-тетрагидроптеридин (Гидроптерин) формулы I в виде гидрата или солей при концентрации 10-6 - 10-5 г/л. При использовании данного регулятора роста для повышения биохимической активности микроорганизмов указанный раствор вводят в ферментационную среду, при этом увеличивается биомасса микроорганизмов и накопление продуцируемых ими веществ. При использовании данного регулятора роста для повышения биохимической активности растений раствором указанного вещества обрабатывают семена и зеленую часть растений, что позволяет увеличить длину стебля, корней, количество листьев, сократить сроки всхожести, роста и развития растений. 3 с.п. ф-лы, 9 табл.
Изобретение относится к органической химии и биотехнологии, а именно к регуляторам роста микроорганизмов и растений на основе гетероциклических соединений с цитокининовыми свойствами, увеличивающими биохимическую активность микроорганизмов и растений.
Известен способ регулирования роста яровой пшеницы, ярового и озимого ячменя путем использования биологически активного вещества на основе пиримидинметанолов в смеси с хлорхолинхлоридом, см. авторское свидетельство СССР N 1409118 по кл. A 01 N 43/54, опубл. 1988 г. Недостатком этого способа является то, что хлорхолинхлорид используется узко - только для яровой пшеницы. Известно улучшение качества и увеличение урожая ситника при применении N-6-бензиладенина в дозе 2,5-25 г/га в составе твердого или жидкого препаратов, см. заявку Японии N 56 - 139666 по кл. A 01 N 43/90, опубл. 1983 г. Известное применение N-6-бензиладенина ограничено в использовании - только для ситника. Известно влияние пуриновых соединений гипоксантина, аденина, кинетина, гуанозина на стимулирующее действие на микроорганизмы при культивировании молочных бактерий, см. Михлин Э.Д., Радина В.П. Активация молочнокислых бактерий // Прикладная биохимия и микробиология. - 1983. - Т. XVII, вып. 3. - С. 353-354. Указанные пуриновые соединения способствуют накоплению молочной кислоты, но процесс накопления длительный, что снижает экономичность использования. Известен способ регулирования роста люцерны, включающий обработку при бутонизации водным раствором, содержащим регулятор роста и группы пиримидинового ряда, см. патент Российский Федерации N 1810036 по кл. A 01 N 43/00, опубл. 1993. Этот способ ограничен по режимам обработки и используется только в стадии бутонизации люцерны. Известен регулятор роста (




- реакционную массу охлаждают сначала до комнатной температуры, затем выдерживают в ледяной воде в течение 2 часов и в холодном состоянии отфильтровывают белый кристаллический осадок;
- осадок отжимают от маточного раствора и промывают водой до отрицательной реакции на ион брома и отсутствия примесей 5,5- дибром-6-окси-5,6-дигидроурацила;
- осадок отжимают и сушат в сушильном шкафу при температуре 70-75oC до постоянного веса;
- получают 816,7 г (95%) 5-бромурацила в виде бесцветных кристаллов с т. пл. 303-305oC с разл. ; хроматографически однороден - Rf = 0.45 в системе метанол-хлороформ - 1: 4, силуфол УФ 254. Вычислено для C5H3BrN2O2 (М.м. 191.05), %: Br - 41.83, N - 14.66. Найдено, %: Br - 41.67, N - 14.59;
- ПМР спектр, ДМСО-d6,





- 1410 мл 70%-ного водного раствора этилендиамина (d=0.975) загружают в трехгорлую колбу объемом 4 л, снабженную обратным холодильником, термометром, эффективной мешалкой;
- смесь нагревают до 70-75oC на водяной бане и прибавляют небольшими порциями 860 г (4.5 моль) 5-бромурацила в течение 1 часа. При этом температура реакционной массы не должна превышать 85oC;
- наблюдается растворение исходного 5-бромурацила, а затем происходит кристаллизация продукта реакции;
- смесь перемешивают при 80-85oC в течение 1.5 часов до исчезновения на хроматограмме исходного урацила;
- реакционную массу охлаждают до 50-60oC и приливают при перемешивании 1.5 л метилового спирта;
- смесь нагревают при 70-75oC и перемешивают в течение 1 часа;
- смесь охлаждают ледяной водой в течение 3 часов и осадок отфильтровывают;
- осадок хорошо отжимают от раствора, промывают 450 мл 70% метанола, маточный раствор отделяют для регенерации метанола и этилендиамина, отжимают от растворителя и сушат до постоянного веса;
- получают 651 г (85%) 2-оксо-(3H)-5,6,7,8-тетрагидроптеридина моногидрата (гидроптерина) в виде светло-желтых кристаллов с т. пл. 200 - 205oC с разл. ; хроматографически однороден Rf = 0.8 в системе 5% NH4Cl, силуфол УФ 254. Вычислено для C6H10N4O2 (М. м. 170.18), %: C - 42.31, Н - 5.87, N - 32.94. Найдено, %: C - 42.26, Н - 5.81, N - 32.89. Препарат стандартизирован по физико-химическим показателям:
- ПМР спектр, ДМСО-d6,











Гидроптерин растворяется в разбавленных щелочах, минеральных кислотах с образованием солей, нерастворим в хлороформе, бензоле, эфире. Растворимость в кипящем спирте 1 г/50 мл, в кипящей воде - 1 г/30 мл (хорошо кристаллизуется). Процесс получения 5-бромурацила может быть совмещен со стадией его конденсации с этилендиамином, то есть технологический процесс получения гидроптерина из урацила упрощается и проводится в одном реакторе. Затраты на производство гидроптерина невелики и стоимость продукта определяется лишь ценой недорогого исходного сырья (урацила, брома, этилендиамина). Заявленный раствор содержит биологически активное вещество 2-оксо-(3H)-5,6,7,8 тетрагидроптеридин (Гидроптерин) формулы

в виде гидрата или солей при концентрации 10-6-10-5 г/л. Способ интенсификации процессов метаболизма микроорганизмов состоит в следующем и поясняется примерами. Готовят водный раствор гидроптерина: гидроптерин в количестве 1 мг растворяют в 1 г воды. Готовят ферментационную среду: посевной материал вносят в стерильную среду в соотношении 10% к объему среды. Водный раствор гидроптерина в количестве 1 мл вводят в (10 мл; 100 мл; 1000 мл; 10000 мл) ферментационной среды, соответственно, и получают концентрации гидроптерина 10-4; 10-5; 10-6; 10-7 г/л. Пример 2. Посевной материал: дрожжи Saccharomyces cerevisiae шт. АТСС-7754 с титром живых клеток 107 кл/мл. Стерильная минеральная среда, г/л:
Глюкоза - 10,0
(NH4)2SO4 - 2,5
К2HPO4 - 3,0
MgSO4

Дрожжевой экстракт - 1,0
Дрожжи культивируют в аэробных условиях на ротационной качалке при 220 об/мин в течение 4-х суток и определяют накопление биомассы в культуральной среде. Результаты опыта представлены в табл. 1. Из табл. 1 видно, что наиболее эффективная и экономичная концентрация раствора гидроптерина 10-6 - 10-5 г/л. Этот предел концентраций способствует увеличению численности дрожжей на 53% на 4-е сутки. Вне указанного диапазона концентраций использование гидроптерина становится менее эффективным и экономичным. Примечание:
1. Посевной материал взят из учебной коллекции кафедры технологии микробиологического синтеза Санкт-Петербургского государственного технологического института (технического университета). 2. Контрольный вариант не обрабатывают гидроптерином. Пример 3. Посевной материал: дрожжи Saccharomyces cerevisiae шт. АТСС-7754 с титром живых клеток 106 кл/мл. Стерильная минеральная среда Крючковой, г/л:
Глюкоза - 20,0
NH4H2PO4 - 5,0
K2SO4 - 0,5
MgSO4

Дрожжевой экстракт - 1,0
Условия культивирования среды: дрожжи культивируют в анаэробных условиях в течение 3-х суток и после этого определяют содержание спирта в культуральной среде. Результаты опыта представлены в табл. 2. Из табл. 2 видно, что наиболее эффективная и экономичная концентрация раствора гидроптерина - 10-6 - 10-5 г/л. Этот предел концентраций способствует увеличению бродильной активности дрожжей и повышает выход спирта на 22-40% на 3-й сутки. Вне указанного диапазона концентраций использование гидроптерина становится менее эффективным и экономичным. Примечание:
1. Посевной материал взят из учебной коллекции кафедры технологии микробиологического синтеза Санкт-Петербургского государственного технологического института (технического университета). 2. Контрольный вариант не обрабатывают гидроптерином. Пример 4. Посевной материал: водоросли Clorella vulgaris шт. 157 с титром живых клеток 106 кл/мл. Стерильная минеральная среда Хата, г/л:
Глюкоза - 10,00
(NH4)2HPO4 - 1,50
K2HPO4 - 1,50
MgSO4

CaCl2 - 0,50
NaCl - 0,50
FeSO4

Дрожжевой экстракт - 1,0
Условия культивирования среды: водоросли культивируют в аэробных условиях при дневном освещении 2000 лк в течение 4-х суток и определяют накопление биомассы в культуральной среде. Результаты опыта представлены в табл. 3. Из табл. 3 видно, что наиболее эффективная и экономичная концентрация раствора гидроптерина - 10-6 - 10-5 г/л. Этот предел концентраций способствует увеличению количества клеток водорослей на 23-31% на 2-е сутки. Вне указанного диапазона концентраций использование гидроптерина становится менее эффективным и экономичным. Примечание:
1. Посевной материал взят из коллекции БНШ АН РФ. 2. Контрольный вариант не обрабатывают гидроптерином. Пример 5. Посевной материал: бактерии Streptococcus bovis шт. АТСС-49133 с титром живых клеток 109 кл/мл. Стерильная крахмалсодержащая среда, г/л:
Мука пшеничная - 10,00
Препарат глюкоамилазы с активностью 2000 м.е. - 0,05
Условия культивирования среды: бактерии культивируют в анаэробных условиях при температуре 40oC в течение 73 часов и определяют накопление молочной кислоты в культуральной среде. Результаты опыта представлены в таблице 4. Из таблицы 4 видно, что наиболее эффективная и экономичная концентрация раствора гидроптерина - 10-6-10-5 г/л. Этот предел концентраций способствует увеличению накопления молочной кислоты на 20-28% через 73 часа. Вне указанного диапазона концентраций использование гидроптерина становится менее эффективным и экономичным. Примечание:
1. Посевной материал взят из учебной коллекции кафедры технологии микробиологического синтеза Санкт-Петербургского государственного технологического института (технического университета). 2. Контрольный вариант не обрабатывают гидроптерином. Пример 6. Посевной материал: бактерии Streptococcus bovis шт. АТСС-49133 с титром живых клеток 109 кл/мл. Стерильная инулинсодержащая среда, г/л: мука топинамбура 100
Условия культивирования среды: бактерии культивируют в анаэробных условиях при температуре 40oC в течение 73 часов и определяют накопление молочной кислоты в культуральной среде. Результаты опыта представлены в таблице 5. Из таблицы 5 видно, что наиболее эффективная и экономичная концентрация раствора гидроптерина - 10-6 - 10-5 г/л. Этот предел концентраций способствует увеличению накопления молочной кислоты на 26-31% через 73 часа. Вне указанного диапазона концентраций использование гидроптерина становится менее эффективным и экономичным. Примечание:
1. Посевной материал взят из учебной коллекции кафедры технологии микробиологического синтеза Санкт-Петербургского государственного технологического института (технического университета). 2. Контрольный вариант не обрабатывают гидроптерином. Способ повышения биохимической активности растений осуществляют следующим образом. Готовят водный раствор гидроптерина: гидроптерин в количестве 1 мг растворяют в 1 л воды, 1 мл раствора переносят в 10 мл; 100 мл; 1000 мл; 10000 мл воды, соответственно, и получают водные растворы гидроптерина с концентрациями 10-4; 10-5; 10-6; 10-7 г/л. Пример 7. Растения:
- однолетнее семейство злаковых РАЙГРАС;
- горох кормовой. Водный раствор гидроптерина при концентрациях: 10-4; 10-5; 10-6; 10-7 г/л. Условия обработки семян:
- семена замачивают в водном растворе гидроптерина указанных концентраций, соответственно, на 1 час;
- выдерживают в течение 1 часа;
- высаживают на глубину 0,5 см;
- определяют количество проросших семян через 3-4 дня;
- измеряют длину проростка через 7 дней. Результаты опыта представлены в таблице 6. Из таблицы 6 видно, что наиболее эффективная и экономичная концентрация раствора гидроптерина - 10-6 - 10-5 г/л. Этот предел концентраций способствует увеличению количества проросших семян у РАИГРАСа на 20-23% и у гороха на 56-59%, и увеличению длины проростка у РАИГРАСа на 15-21% и у гороха на 8-10%. Вне указанного диапазона концентраций использование гидроптерина становится менее эффективным и экономичным. Примечание: контрольный вариант не обрабатывают гидроптерином. Пример 8. Растения: горох, огурцы, бархотцы. Водный раствор гидроптерина при концентрации 10-6 г/л. Условия обработки семян:
- семена замачивают в водном растворе гидроптерина на 1 час;
- выдерживают в течение 1 часа;
- высаживают на глубину 0,5 см;
- определяют всхожесть через 4-7 дней. Результаты опыта представлены в таблице 7. Из таблицы 7 видно, что обработка семян раствором гидроптерина значительно активизирует энергию и дружность прорастания семян. Всхожесть семян гороха на пятые сутки достигает 98%. Всхожесть семян огурцов и бархотцев на четвертые сутки достигает 96% и 98%. В то время как максимальная всхожесть на контроле наблюдается только на седьмые сутки. Использование гидроптерина повышает всхожесть семян и сокращает время их прорастания на трое-четверо суток. Примечание: контрольный вариант не обрабатывают гидроптерином. Пример 9. Растения: - томаты, капуста, редис, лук, укроп;
- горох;
- люпин. Водный раствор гидроптерина при концентрации 1

- семена замачивают;
- семена выдерживают в течение 1 часа;
- семена высаживают на глубину 0,5 см. Вариант с обработкой семян гидроптерином с последующим опрыскиванием зеленой части растений:
- семена замачивают;
- семена выдерживают в течение 1 часа;
- семена высаживают на глубину 0,5 см;
- зеленую часть растений опрыскивают 1 раз в неделю раствором гидроптерина;
- зеленую часть растений опрыскивают раствором гидроптерина в течение 5 недель. Результаты опыта представлены в табл.8. Из табл.8 видно, что после обработки семян раствором гидроптерина у всех исследованных растений по сравнению с контролем наблюдается увеличение длины стебля от 6 до 133%, увеличение длины корня - от 12 до 53%, увеличение количества листьев - от 33 до 78%. Еще более эффективно сочетание замачивания семян с последующим опрыскиванием зеленой части растений раствором гидроптерина один раз в неделю в течение 5 недель. При таком режиме обработки увеличение длины стебля по сравнению с контролем у всех исследованных растений составляет от 10 до 181%, увеличение длины корня - от 17 до 110%, увеличение количества листьев - от 78 до 175%. Примечание: контрольный вариант не обрабатывают гидроптерином. Проведено сравнение использования предложенного регулятора роста с известными регуляторами роста. Пример 10. Растение: Plectrantus austrelis. Регуляторы роста:
- лентехнин;
- индолилуксусная кислота (

- бензиламинопурин (6-БАП) - прототип;
- гидроптерин. Результаты опыта представлены в таблице 9. Из табл. 9 видно, что наиболее эффективным и экономичным является гидроптерин. При использовании гидроптерина в виде раствора с концентрацией 10-6 г/л масса корня и стебля Plectrantus austrelis увеличивается по отношению к контролю на 119 и 143% соответственно. Использование 6-БАП (прототип) при такой же концентрации приводит к увеличению массы корня на 104%, а стебля - на 106%. Повышение концентрации 6-БАП до 10/ г/л не приводит к приросту массы корня и стебля. Использование раствора индолилуксусной кислоты (

- повысить эффективность биохимических процессов;
- сократить сроки роста, развития растений и метаболизма микроорганизмов и растений;
- увеличить биомассу микроорганизмов;
- повысить выход спирта в процессе брожения;
- увеличить накопление молочной кислоты в процессе брожения;
- увеличить длину стебля, массу корней растений;
- сократить сроки всхожести, роста и развития растений.
Формула изобретения

в виде гидрата или солей при концентрации 10-6 - 10-5 г/л. 2. Способ повышения биохимической активности микроорганизмов путем воздействия на процессы их роста и метаболизма раствором биологически активного вещества, отличающийся тем, что в качестве биологически активного вещества берут 2-оксо-(3H)-5,6,7,8-тетрагидроптеридин по п.1 и вводят в ферментативную среду до достижения концентрации 10-6 - 10-5 г/л. 3. Способ повышения биохимической активности растений путем воздействия на процессы роста и развития раствором биологически активного вещества, отличающийся тем, что в качестве биологически активного вещества берут 2-оксо-(3H)-5,6,7,8-тетрагидроптеридин по п. 1 и готовят раствор концентрации 10-6 - 10-5 г/л.
РИСУНКИ
Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10, Рисунок 11