Способ получения аутоактиватора роста для культивирования еsснеriснiа coli

 

Изобретение относится к биотехнологии , а именно к способам получения стимулирующих добавок к питательным средам при выращивании микроорганизмов. С целью повышения биологической активности ауторегулятора роста и упрощения способа клетки Escherichia coll M-17 инкубируют в дистиллированной воде при комнатной температуре в течение 5-9 сут. Для получения аутоактиватора используют суспензию клеток с концентрацией до 20 млрд/мл. Активность полученного препарата почти в 60 раз превышает активность известного препарата. Отсутствие в фильтратах с аутоактиватором компонентов питательной среды облегчает их лиофильную сушку. Сухие препараты обладают повышенной удельной активностью и улучшенными физико-химическими свойствами (сыпучесть, низкая гигроскопичность), Облегчается возможность дальнейшей очистки препарата. 1 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

k (21) 4615617/13 (22) 06,12.88 (46) 30,03,91. Бюл, N. 12 (71) Всесо юзн ый научно-исследовател ьский институт особо чистых биопрепаратов (72) Т.Я.Вахитов и О,Ю.Яшина (53) 577.15 (088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

N 491691, кл. С 12 N 1/00, 1974, Пшеничнов P.À., Колотов В.М„Барихин С.Л„Ткаченко А.Г. и Дедюкина М.M.

Микробная популяция — саморегулируемая система. Экология и популяционная генетика микроорганизмов. УНЦ АН СССР, 1975, с. 3 — 13. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АУТОАКТИВАТОРА РОСТА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ

ESCHERICHIA СО1! (57) Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам получения стимуИзобретение относится к биотехнологии, а именно к способам получения стимулирующих добавок к питательным средам при выращивании микроорганизмов.

Цель изобретения — повышение биологической активности ауторегулятора роста и упрощение способа.

Предлагаемый способ заключается в том, что для получения ауторегулятора роста в виде бесклеточного микробного фильтрата клетки Escherichia coll M-17 инкубируют в дистиллированной воде при комнатной температуре в течение 5 — 9 сут.

Основным активатором роста является низкомолекулярное (около 500 у,ед) соединение, отличающееся по хроматографическим

„„ Ц„„1638156 Al (я)5 С 12 N 1/00, 1/38 // (С 12 N 1/00, С 12 R 1:19) лирующих добавок к питательным средам при выращивании микроорганизмов. С целью повышения биологической активности ауторегулятора роста и упрощения способа клетки Escherichla coll М-17 инкубируют в дистиллированной воде при комнатной температуре в течение 5-9 сут, Для получения аутоактиватора используют суспензию клеток с концентрацией до

20 млрд/мл. Активность полученного препарата почти в 60 раз превышает активность известного препарата. Отсутствие в фильтратах с аутоактиватором компонентов питательной среды облегчает их лиофильную сушку. Сухие препараты обладают повышенной удельной активностью и улучшенными физико-химическими свойствами (сыпучесть, низкая гигроскопичность), Облегчается возможность дальнейшей очистки препарата. 1 табл. свойствам от аминокислот и нуклеотидов, не используемое бактериями в качестве питательного субстрата и обладающее, по всей видимости, чисто регуляторными функциями.

Способ осуществляют следующим образом.

Клетки бактерий Escherichia соИ M-17 отделяют центрифугированием от питательной среды, ресуспендируют в равном обьеме 0,97;-ного раствора NaCI, осаждают и вновь ресуспендируют в дистиллированной воде до концентрации 20 млрд/мл, выдерживают в защищенном от света месте в течение 5 — 9 сут при комнатной температуре. Затем отделяют клетки Е. coll M-17 цен1638156

50 трифугированием. Надосадочную жидкость стерилизуют фильтрованием (фильтр

Milli pore; 0,22 мкм).

Биологическую активность препарата определяют культивированием бактерий

Е. coli M-17 в синтетической глюкозоминеральной среде с добавкой аутоактиватора.

Пример 1, Культивирование бактерий

Е, coll M-17 проводят в стандартной безбелковой минимальной синтетической среде M9 при 37 С во флаконах с постоянным перемешиванием среды. Засевная доза составляет 25 млн/мл. В намеченные сроки культуру фильтруют через бактериальные свечи К-5 с размером пор 0,9 мкм под отрицательным давлением 80 — 150 мм. Для оценки активирующего действия в фильтрат. содержащий аутоактиватор, засевают отмытую бульонную культуру Е. coli M-17 в дозе 15 млн/мл. Для контроля производят посев аналогичной дозы клеток бактерий в свежую синтетическую среду M-9, Зависимость активирования от срока развития исходной культуры (по известному способу) представлена ниже.

Индекс стимуляции — частное от деления концентрации микробов в опытной пробе на концентрацию их в контроле, количественные показатели соответствуют активности препарата в известном способе.

Пример 2. Отмытые от культуральной жидкости клетки Е, соП M-17, выращенные до конца логарифмической фазы, помещают в 200 мл дистиллированной воды в концентрации 20 млрд/мл, Выдерживают в защищенном от света месте при комнатной температуре 9 сут. Отделяют бактериальные клетки центрифугированием (3000 об./мин, 30 мин) на отечественной центрифуге К-70. Надосадочную жидкость с аутоактиватором фильтруют (фильтр

Milli pore, 0,22 мкм).

Для проверки активирующего действия

1 мл фильтрата с аутоактиватором, разбав5

35 ленного в 125 раз, смешивают с 1 мл глюкозоминеральной среды, содержащей все необходимые для роста компоненты в удвоенных концентрациях и клетки Е. coli

М-17 (2 10 xn/мл).

Состав глюкозоминеральной среды, г/л: глюкоза 6,0; Ма2НРО4 2,0; КН2РО4 (водный) 2,0; цитрат аммония 9,0; NaCI 10;

Ка2СОз 3,0; MgSO4 (водный) 0,4; никотиновая кислота 0,01.

B контрольную пробирку вместо аутоактиватора вносят равный объем дистиллированной воды. Культивирование проводят 5 ч при 37 С, Остановку роста осуществляют путем помещения пробирок в ледяную баню на 10 мин, Прирост биомассы оценивают спектрофотометрически на спектрофотометре СФ-46 при длине волны 460 нм. Индекс стимулирования (ИС) вычисляют так же, как в известном способе.

Динамика изменения ИС разбавленного в 125 раз аутоактиватора, полученного по. предлагаемому способу, в процессе выдерживания представлена в таблице.

Таким образом, активность полученного препарата почти в 60 раз выше, чем препарата, полученного по известному способу, Отсутствие в фильтратах с аутоактиватором компонентов питательной среды облегчает их лиофильную сушку. Полученные сухие препараты обладают повышенной удельной активностью и улучшенными физико-химическими свойствами (сыпучесть, низкая гигроскопичность). Облегчается возможность дальнейшей очистки аутоактиватора, Формула изобретения

Способ получения аутоактиватора роста для культивирования Escherichla coll M17, предусматривающий инкубирование клеток в жидкой среде с последующими отделением культуральной жидкости и ее стерилизацией, отл и ч а ю щи и с я тем, что, с целью повышения биологической активности продукта и упрощения способа, в качестве жидкой среды для инкубирования используют дистиллированную воду, а инкубацию проводят при комнатной температуре в течение 5 — 9 сут,