Способ определения кооперации гранулоцитов и моноцитов

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)л G О1 N 33/53

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4675072/14 (22) 03,02.89 (46) 15.10.91. Бюл. М 38 (71) Витебский медицинский институт (72) Г.П.Адаменко (53) 615.375(088.8) (56) Аналогов в литературе не обнаружено. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КООПЕРАЦИИ ГРАНУЛОЦИТОВ И МОНОЦИТОВ (57) Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано при оценке иммунного статуса в звене гранулоцит-моноцит. Цель иэобреИзобретение относится к медицине, в частности к иммунологии, и может быть использовано в оценке иммунного статуса человека, а именно для выявления нарушений взаимодействия в звене моноцит-гранулоцит.

Целью изобретения является создание способа определения кооперации моноцитов и гранулоцитов.

Способ осуществляют следующим образом, Гепариниэированную (20 ЕД/мл) венозную кровь в объеме 5 — 6 мл наслаивают на 2 мл раствора Фиколл — Гипак с плотностью

1,114 г/см и центрифугируют при 400 g

40 мин. Фракции мононуклеаров и гранулоцитов собирают отдельно и 3 раза отмывают изотоническим фосфатным буфером (ИФ6), рН 7,2. центрифугируя при 200 g 10 мин.

Затем из осадка мононуклеаров приготавливают суспензию клеток 2х10 в мл на среде RPMI-1640 с 20 -ной инактивированной

АВ (IV) сывороткой, 20 мМ глютамина и 100

„„SU „1684684 А! тения — определение кооперации гранулоцитов и моноцитов. Для достижения указанной цели используется капиллярный вариант реакции торможения миграции лейкоцитов иэ капиллярных трубок в присутствии моноцитов, при этом оценивают результат реакции через 6 ч и при повышении миграционной способности оценивают стимулирующее влияние моноцитов на гранулоциты, По изменению взаимоотношений в системе гранулоцит — моноцит можно определять иммунодефицитное состояние организма. мкг/мл гентамицина (КС). Суспенэию в объеме 3 мл вносят в пластиковую чашку Петри и инкубируют при 37 С, 5 -ным С02 !00 ный влажности в течение часа. Неприлипшие клетки удаляют, прилипшие осторожно прополаскивают 3 раза средой 199 и инкубируют при 4 С в течение 20 мин в среде

RPMI — 1640 с 10 мМ ЭДТА, Отслоившиеся клетки собирают, отмывают 3 раза средой

199 и ресуспендируют до концентрации

1Х10 в мл. Морфологическая (окраска по

Романовскому — Гимэа) и цитохимическая (неспецифическая экстераза) оценки показали, что эта суспензия клеток на 82 — 89

СОСТОИТ Иэ МОНОЦИТОВ.

Гранулоциты, полученные после центрифугирования крови в градиенте ФиколлГипак, отмывают 3 раза ИФБ и ресуспендируют до концентрации 1х!О в мл в среде RPMI — 1640. Морфологический анализ показал, что эта суспензия клеток на

96 — 97 состоит из гранулоцитов.

16846534

ИМ = — --—

Иэ о" адка эри;ос цитов после 3 Kpd1Ho го о мывания ИФЬ готовя1 суспензию

1х10 в мл на среде RPMI 1640.

В ряд центрифужных пробирок вносят по 0,2 мл суспензии гранулоцитов. Затем в часть из ниx добавляюT разные обьемы (0,02 — 0,2 мл) суспензии моноцитов или эритроцитов, содержащих разные количества клеток, B остальные, вместо клеток, вносят среду RPMI -1640. Все пробирки центрифугируют при 200 g 5 мин, надосадочные жидкости удаляют. Осадки клеток ресуспендируют в 0,2 мл культуральной среды (КС), Полученными смесями клеток (моноциты и гранулоциты, или эритроциты и гранулоциты, или одни гранулоциты) заполняют капиллярные трубки (по 3 каждой смесью) длиной 1,5 см и диаметром 1,2 -1,4 мм, которые запаяны с одного конца. Затем капилляры с клетками помещают открытыми концами в ячейки 96-луночных круглодонных планшет, в которые предварительно внесено по 0 1 мл КС. Планшеты закрывают крышкой и помещают в термостат при 37 С, 5 -ного СО 100 4-ной влажности на 24 ч. Оценку реакции проводят через 1,3; 6; 12 и 24 ч по количеству клеток, вышедших из капилляров в среду ячейки, путем подсчета в камере Горяева.

Показателем интенсивности миграции служит индекс миграции (ИМ), который высчитывают по формуле где К вЂ” среднее число клеток, вышедших из

3 капилляров, содержащих гранулоциты с моноцитами или эритроцитами;

Π— среднее число клеток, вышедших из

3 капилляров, содержащих гранулоциты.

Статистическую обработку результатов проводили с помощью критерия Стьюдента, Результаты. B процессе отработки предлагаемого метода оценки изменения миграции гранулоцитое под влиянием моноцитов были подобраны оптимальные концентрации взаимодействующих клеток, Гранулоциты были использованы в концентрации 1х10 в мл. которая согласно литературным данным является оптимальной в оценке миграции лейкоцитов. Индекс миграции (ИМ) одних гранулоцитов из капилляров был принят эа 1. Количество моноцитое. необходимое для выполнения предлагаемого метода, было подобрано экспериментально. Оказалось, что моноциты в концентрации 1х10 в мл наиболее еыражег ны (P < 0,05) стимулировали миграцию гранулоцитое. Морфологическая оценка

20 ч5

55 кпе1ок, мигрироваеших из капилляров, показала. что 95 -97 их являются гранулоцитами. Полученная стимуляция миграции гоанулоцитов под влиянием моноцитов может быть вызвана пассивно, т.е. за счет механического присутствия клеток, Для проверки этого предположения вместо моноцитов к гранулоцитам добавляли эквивалентное количество эритроцитов. Иэ результатов видно, что в отличие от моноци1ов эритроциты в используемых концентрациях практически не изменяли миграцию гранулоцитов из капилляров. Следовательно, стимуляция миграции гранулоцитов мо-. ноцитами не была связана с созданием ими механических помех, а обусловлена действием моноцитов.

В отличие от общепринятых методов, миграционную активность гранулоцитов оценивали в динамике процесса миграции, что позволило дать оценку кинетике этого процесса. Результаты исследований показали, что уже через 3 ч моноциты значительно (P < 0,05) стимулируют миграцию гранулоцитов, достигая максимального уровня через 6 ч. В дальнейшие сроки наблюдения (до 24 ч) ИМ гранулоцитов снижался, но оставался достоверно больше (Р<0,05) ИМ гранулоцитов е отсутствие моноцитов, Полученные результаты показали, что миграция гранулоцитов крови человека модулируется моноцитами в сторону стимуляции. Этот процесс обусловлен активным взаимодействием этих клеток, так как вопервых, миграционная активность гранулоцитов не изменяется под влиянием эритроцитов, и, во-вторых, стимуляция миграции гранулоцитов наступает после определенного времени культивирования взаимодействующих клеток.

Таким образом, способность моноцитов стимулировать миграцию гранулоцитов е капиллярном варианте реакции миграции лейкоцитов можно использовать для более полной оценки иммунного статуса, а именно на уровне взаимодействия моноцитов и гранулоцитов. Таким способом можно выявить иммунодефицитные состояния, что позволит проводить целенаправленную иммунокорригирующую терапию.

Использование способа подтверждается примерами.

Пример 1. Донор станциии переливания крови. При оценке иммунного статуса не выявлено отклонений от нормы (Т-лимфоциты, 1,02х10 в мкл; В-лимфоциты 0,3х10

g е мкл. Сывороточные иммуноглобулины..

Джи -12,3 мгф,, М вЂ” 1.03 мг (,, А--2,43 мг .

Эагоцитоз: фагоцитарный индекс (ФИ) 1684684

Составитель Г. Крюкова

Редактор А. Маковская Техред М.Моргентал Корректор С, Черни

Заказ 3503 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета flo изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва. Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

63 (, фагоцитарное число (ФЧ) 17, НСТтест: спонтанный — 5,7 (,, стимулированный — 32,97). Проведена оценка иммунного статуса на уровне взаимодействия моноцитов с гранулоцитами, Постановка реакции миграции лейкоцитов показала, что в присутствии моноцитов наблюдается стимуляция миграции гранулоцитов (ИМ - 2,74). Полученные данные свидетельствуют о том, что в условиях нормального иммунного статуса у здоровых людей наблюдается стимуляция миграции гранулоцитов под влиянием моноцитов, Пример 2. Больной К. с диагнозом; псориаз. На основании проведенных иммунологических исследований (Т-лимфоциты—

0,65х10 в мкл; В-лимфоциты — 0,51х10 в мкл. Сывороточные иммуноглобулины: Джи — 24,2 мг$, М вЂ” 0,87 мг, А — 1,36 мг$.

Фагоцитоз; ФЧ вЂ” 15, ФИ вЂ” 60,7 . НСТ-тест: спонтанный — 1,4, стимулированный—

17,2,ф) выявлено нарушение иммунного статуса. Эти данные недостаточны для полной оценки иммунного статуса, так как не позволяютт оценить его на уровне взаимодействия моноцитов с гранулоцитами, Такие исследования дают возможность более точно выявить иммунодефицитное состояние и назначить целенаправленную иммунокорригирующую терапию. Постановка реакции миграции лейкоцитов у данного больного показала, что в присутствии моноцитов стимуляция миграции гранулоцитов (ИМ вЂ” 1,62) снижена на40,8 посравнениюсданными, полученными в примере 1. Следовательно, выполненные исследования свидетельствуют о иммунодефиците в звене моноцит— гранулоцит у больного K., что указывает на необходимость проведения целенаправленной иммунокорригирующей терапии.

Пример 3. Больной 8. с диагнозом: экзема. На основании проведенных иммуннологических исследований (Т-лимфоциты

1,23х10 в мкл; В-лимфоциты — 0,29х10 в мкл. Сывороточные иммуноглобулины: Джи — 14,7 мг . М вЂ” 1,04 мг 0 А — 2,97 мг, Фагоцитоэ: ФЧ вЂ” 12,2; ФИ вЂ” 53,4 . НСТтест: спонтанный — 4,8 }ь, стимулированный

45 — 40,7 ) не выявлено изменений иммунного статуса. Для полной его оценки исследовано взаимодействие моноцитов с гранулоцитами в реакции миграции лейкоцитов.

Обнаружено, что в присутствии моноцитов наблюдается стимуляция миграции гранулоцитов (ИМ = 4,34), которая на 58,4 выше стимуляции миграции гранулоцитов под влиянием моноцитов, полученной в примере 1, и намного выше данных, полученных в примере 2. На основании этого можно констатировать, что у больного В, при отсутствии нарушений в иммунном статусе, по данным общепризнанной оценки, выявлено иммунодефицитное состояние в звене моноцит — гранулоцит, что указывает на необходимость назначения соответствующей иммунокорригирующей терапии.

Таким образом, приведенные клинические примеры показывают, что предлагаемый способ оценки иммунного статуса позволяет более полно обнаружить нарушения в иммунной системе организма, что является важным для проведения иммунокорригирующей терапии.

Преимущества предлагаемого способа:

1. Впервые в реакции миграции лейкоцитов показана стимуляция миграции гранулоцитов под влиянием моноцитов.

2. Установлен иммунодефицит в системе взаимодействия моноцитов с гранулоцитами у больных с и без вторичного иммунодефицитного состояния.

3. Воэможность дать более полную оценку иммунного статуса, что важно в практическом здравоохранении для выявления иммунодефицитных состояний и проведения адекватной иммунокорригирующей терапии.

Формула изобретения

Способ определения кооперации гранулоцитов и моноцитов путем постановки реакции миграции лейкоцитов в капиллярах в присутствии моноцитов и при повышении миграционной способности определяют стимулирующее влияние моноцитов на гранулоциты.